基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

泰安樱桃根癌病致病菌分离及生物型鉴定

由致病性土壤杆菌侵染引起的根癌病严重影响了樱桃树的生长?利用选择性培养基, 以阿糖醇和赤藓糖醇作为不同碳源, 从山东泰安食用樱桃根部瘤状组织和感病根际土壤中分离到土壤杆菌100余株, 通过胡萝卜切片法和番茄茎部针刺接种法从中筛选到31株有致瘤活性的菌株?经16S rDNA和recA基因序列分析, 结合生物型检测鉴定出96%以上的致病菌属原生物Ⅱ型(Agrobacterium rhizogenes), 只有1株致病菌为原生物Ⅰ型(A. tumefaciens)?根据Ti质粒上致病相关基因保守序列设计3对引物, 12株有致瘤活性菌株中11株PCR扩增到目的条带?经分子生物学测定和高压纸电泳检测, 所有致病菌株的质粒均为胭脂碱型?建立了致病型土壤杆菌的分子生物学快速鉴定方法, 为定向选择生防菌株提供基础?     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系探索

对根癌农杆菌介导的水稻遗传转化受体系统的几个重要因素进行试验,得到157个抗性愈伤组织.对于滇优粳3号和滇优粳5号,4mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA搭配,蔗糖浓度为20～30g/L时比较有利于愈伤组织形成.滇优粳3号和滇优粳5号的愈伤组织对潮霉素较敏感,30～50mg/L的潮霉素浓度为有效的筛选浓度.     

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立

以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。     

以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究

为了进一步建立优化的根癌农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系,提高海岛棉外源基因转化率。以生理状态基本一致的海岛棉新海30号的胚性愈伤组织为受体材料,以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因,将浸染时间和共培养时间作为试验要素,筛选适宜的浸染时间和共培养时间。结果表明,根癌农杆菌介导的海岛棉外源基因转化体系的最佳浸泡时间为15 min,共培养时间为24 h。     

肿瘤血管生成抑制因子Arresten基因克隆及其对烟草的转化

肿瘤血管生成抑制因子Arresten是人Ⅳ型胶原蛋白α1链羧基末端NC1结构域多肽片段,可抑制新血管生成。研究拟实现该基因对烟草细胞的转化,为进一步利用植物细胞表达该蛋白奠定基础。①采用RT-PCR法从人胎盘组织克隆Arresten基因cDNA,克隆产物经酶切后定向插入到植物双元表达载体pCAMBIA1301的NcoⅠ和BstEⅡ位点之间,构建成含有目的基因的植物表达载体pCA,经PCR、限制性内切酶检测及序列测定正确后,转化根癌农杆菌LBA4404,获得携带目的基因的重组农杆菌。②采用叶盘转化法,以重组农杆菌转化烟草。在hygromy cin选择压力下获得烟草转化不定芽和完整植株,经PCR检测初步证实,Arresten基因已导入烟草基因组中。该研究首次将Arresten基因导入高等植物基因组中,为避免利用原核细胞或动物细胞表达Arresten的潜在问题,以及进一步利用植物进行该基因的大规模廉价表达奠定了基础。     

草莓抗除草剂bar基因工程菌的构建及其检验

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测．用构建的工程菌转化草莓试管苗。研究结果表明,真核表达载体pBI121-bar被成功转入根癌农杆菌LBA4404;草莓试管苗工程菌侵染最佳浓度菌液OD600值为0．5,脱菌Cef适宜浓度200mg／L;已筛选出草莓抗除草剂bar基因抗性芽。     

狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系的建立

狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型,具有热带植物的典型特征,也可作为研究热带作物的重要模型,高效的转基因技术是模式植物广泛服务于科研的基础,目前狗尾草作为模式植物的研究在国外越来越热门,但在国内还没有被关注。但作为模式植物狗尾草现有的转化技术还不完善,转化周期有待缩短,转化效率需要进一步提高。本研究以狗尾草ME34品系不同阶段胚性愈伤为外植体进行农杆菌转化体系研究,通过实验大大提高了狗尾草的转化效率,缩短了转化周期,为狗尾草转基因研究提供了新的技术方法,新方法主要包括以下技术环节:高效胚性愈伤诱导技术,受体胚性愈伤的选择,适宜转化的农杆菌株系及培养条件,浸染和共培养条件与方法,抗性愈伤筛选条件,抗性愈伤成苗条件等。     

几种农杆菌的耐酚性能比较与驯化研究

为了明确不同农杆菌菌种对茶多酚的耐受性能变化幅度,以及驯化培养对提高农杆菌茶多酚耐受性、从而提高茶树遗传转化中遗传转化率的作用与可行性,本文比较了茶多酚对四种农杆菌生长的抑制率,进行了耐酚菌株的驯化培养,最后比较了驯化菌株与原始菌株的转化能力。结果表明:茶多酚对几种农杆菌均有明显的生长抑制作用,但不同菌种的耐受性能差异较大;通过驯化培养得到的耐酚菌株EHA105AP,其耐酚性能提高了90.89%,同时,其在茶树叶片和愈伤中的GUS瞬时表达率也分别提高了43.85%和57.55%。     

发根农杆菌介导的抗病毒基因导入番茄转化系统的建立

试验设置基因型、菌液浓度、外植体和方法 4个因素 ,利用发根农杆菌将抗 TMV (烟草花叶病毒 )的 TMV- CP基因和抗 CMV (黄瓜花叶病毒 )的 CMV- CP基因按 L16( 4 4× 2 3)正交表转化番茄。 Km抗性愈伤组织频率的结果表明 ,不同品种、不同菌液浓度转化频率存在着显著性差异 ,而外值体部位、方法之间差异不显著。并已得到 9株转化再生的番茄植株 ,经 PCR检测和EL ISA检测证明 TMV- CP和 CMV- CP基因已导入番茄并表达