桡足类浮游动物细胞膜与白斑综合症病毒的结合研究

通过差速离心法提取桡足类组织细胞膜，依照本实验室确立的细胞膜与WSSV特异性的结合关系，进行了桡足类细胞膜与白斑综合症病毒(WSSV)结合实验。结果表明，桡足类细胞膜与WSSV之间存在着特异性的结合，二者的结合说明了桡足类细胞膜上存在有WSSV的受体蛋白，其为确定桡足类属于WSSV感染宿主提供了重要证据。同时，比较了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜对桡足类细胞膜与WSSV结合的影响作用，证实了凡纳滨对虾鳃细胞膜对二者的结合具有明显的封闭作用，侧面说明了WSSV在二者细胞膜上存在有相同的受体蛋白或结合位点。桡足类细胞膜经表面活性剂Triton x-100处理后，与WSSV的结合活性没有受到影响，而经Tween-20处理能显著提高与WSSV的结合活性，提示受体蛋白在细胞膜上可能占有一段较小的跨膜区域。经SDS-PAGE分析确定了桡足类细胞膜由分子量为18～207kD范围的约33条蛋白条带组成。     

1个白斑综合症病毒基因的克隆及其在大肠杆菌M15中的表达

根据对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）1个可能编码蛋白的开放读码框（open reading frame，ORF）的序列（WSSV A基因），结合pQE30载体的多克隆位点，设计1对引物进行PCR，扩增出大小为0.28kb的A基因片段。把目的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，构建出重组质粒pGT-A，再用引物两端酶酶切出目的片段，并按正确的读码框顺序插入到pQE30表达载体上的乳糖操纵子中，构建出带有目的片段的重组质粒pQE30-A，然后将重组质粒转化到大肠杆菌M15细胞，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western blot显示有与A基因预期大小11kD相吻合的融合蛋白带。结果表明，来源于WSSV的这一ORF是1个可表达的基因。     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白的研究概况

白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）是严重危害对虾养殖业的病原之一。随着WSSV基因组全序列的公布及蛋白质组学的飞速发展,对WSSV结构蛋白及其相互作用的研究越来越深入。通过对WSSV结构蛋白及其相互作用的分析,进一步研究其在病毒感染过程中的作用,这为有效控制甚至阻断WSSV感染奠定基础。     

中国对虾“黄海2号”新品种的培育

选取中国对虾“黄海1号”、“即抗98”2个养殖群体,朝鲜半岛南海群体、乳山湾群体、青岛沿岸群体及海州湾群体等4个自然群体,采用不平衡巢式交配方案设计,于2005年建立了中国对虾育种的基础群体。设计并建立了中国对虾的多性状复合育种技术,选育的目标性状为生长速度、白斑综合症病毒感染后的存活时间及养殖存活率。为最大限度消除环境差异对遗传方差的影响,在中国对虾家系构建过程中采用标准化程序培育苗种,经过对体长为3cm左右的幼虾进行荧光标记,每个家系标记后混合养殖测试。随机从每个家系中抽取同等数目的标记对虾分成2组,一组共同养殖在养殖池中,测试生长速度和养殖存活率,另一组在封闭的水泥池中进行WSSV感染实验,测试病毒感染后的存活时间长短。中国对虾遗传参数的估计结果表明,养殖170天收获体重的遗传力为0.22,抗WSSV存活时间的遗传力为0.14,存活率的遗传力为0.03。采用BLUP法估算个体育种值,通过百分比加权的形式,分别赋予生长速度、抗WSSV存活时间和存活率的加权值为：80%、15%和5%,并对性状育种值进行标准化,获得综合选择指数;按照每个家系及个体的综合选择指数大小进行家系间及家系内留种,并根据系谱信息,设计交配方案,将每代的近交系数控制在1%以内。选育4代后的统计结果表明,平均每代的遗传进展为：生长速度,13.56%;抗病力,6.76%;存活率,5.05%。三个性状中,收获体重的遗传力最高、加权最大,每代获得的遗传进展稳定在12%以上;抗WSSV存活时间与存活率遗传力较低,每代获得的遗传进展相对小且不稳定。实验培育的新品种“黄海2号”于2009年通过全国水产原良种委员会审定,可在适合中国对虾的养殖区进行推广养殖。为更快地培育抗病新品种,解决对虾养殖病害问题,进一步的研究需查明对虾抗病的遗传机制,提高抗病性状的选择强度,快速培育对虾抗病新品种。     

5种中草药对凡纳滨对虾生长和抗病力的影响

[目的]研究不同中草药对凡纳滨对虾生长和抗病的影响,为对虾的健康养殖提供科学依据。[方法]将黄芪、板蓝根、柴胡、甘草和茯苓经超微粉碎后,分别添加1.5%到基础饲料中,饲喂凡纳滨对虾35 d,研究其对凡纳滨对虾的生长、成活率、饲料系数、消化酶活力、非特性免疫指标及感染WSSV后的抗病力的影响。[结果]各组凡纳滨对虾的增重率和特定生长率大小顺序均为茯苓组黄芪组甘草组柴胡组板蓝根组对照组。各组饵料系数的大小顺序为茯苓组黄芪组甘草组柴胡组板蓝根组对照组。各组对虾存活率的大小顺序为板蓝根组柴胡组甘草组黄芪组茯苓组对照组。不同中草药对凡纳滨对虾肝胰腺消化酶活性的影响不同。各组淀粉酶大小顺序为茯苓组甘草组黄芪组板蓝根组柴胡组对照组;各组脂肪酶大小顺序为甘草组茯苓组黄芪组对照组柴胡组板蓝根组;各组蛋白酶大小顺序为茯苓组黄芪组甘草组板蓝根组对照组柴胡组。5种中草药对凡纳滨对虾肝胰腺非特异性免疫力有影响,其中黄芪组和甘草组对虾的AKP、ACP、POD和SOD活力较高。感染WSSV后,各组凡纳滨对虾的半致死时间顺序为柴胡组板蓝根组黄芪组甘草组茯苓组对照组,各组存活率大小顺序为柴胡组黄芪组板蓝根组甘草组茯苓组对照组。[结论]中草药制剂可以明显提高凡纳滨对虾的生长和抗病力。其中,茯苓的促生长作用较佳,而黄芪、板蓝根、柴胡和甘草可以明显提高其抗病力。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

应用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒研究

用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒,阳性反应呈典型的S曲线,说明本检测探针和引物设计合理。经灵敏度测定,当样品DNA浓度低至100拷贝/μL时,仍可以有效扩增,但在103/μL之上时结果最佳。同时,经过与传统探针检测对比试验得出:用Taqman标记的探针检测相同量的样品时,AllGlo MAR标记的探针(FAM通道)CT值与FAM标记的探针的CT值没有明显区别,但是MAR标记的探针的荧光信号强度要比FAM标记的探针约高40%,更适合于对虾白斑综合征病毒的检测。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白激酶wsv083的初步研究

为探讨VP19和VP28是否由蛋白激酶wsv083催化发生磷酸化,将wsv083、VP19和VP28分别进行原核表达。将wsv083蛋白、wsv083表达菌株的裂解液上清以及去磷酸化的wsv083蛋白分别和2种膜蛋白相互作用,以及将wsv083、VP19和VP28的表达质粒共转化至同一菌株中进行表达。结果均未能发现VP19和VP28被磷酸化,但发现wsv083蛋白自身具有苏氨酸和酪氨酸磷酸化的现象。改变wsv083表达质粒,wsv083蛋白同样出现了磷酸化现象。而在将wsv083的序列改变使其失去激酶活性后,表达出的wsv083蛋白不再具有磷酸化的现象。因此认为VP19和VP28的磷酸化不是由wsv083催化产生,wsv083能够自我磷酸化。     

白斑症病毒在日本对虾体内的感染增殖

用投喂患白斑症病毒病的虾组织人工感染日本对虾稚虾,每日取样,整虾冰冻切片,单克隆抗体的荧光抗体方法,原位观察病毒在虾体内的感染增殖,结果表明：感染后三天内,在感染虾的各组织器官内均未观察到明显的病毒感染的阳性细胞,每四天首先在鳃丝腔内的小量血细胞观察到病毒感染;第五天除血细胞外同时在血窦,鳃上皮组织,皮下组织内观察到,第六天进而在心脏,胃上皮组织内观察到：第七天进一步又在淋巴器官,中肠内观察到,八