弧菌对养殖大菱鲆的危害及其防治方法研究新进展

弧菌是细菌性疾病的常见病原,不但会感染大菱鲆(Scophthalmus maximus),还会对人类健康造成重大危害.大菱鲆是我国重要的海水养殖鱼类,具有较高的经济价值,然而疾病问题严重阻碍了其养殖业的发展.近年来,有关大菱鲆弧菌病检测及防治方面的研究有了新的突破.文章介绍了几种常见弧菌病原对养殖大菱鲆的危害,对新的检...     

rpoS对鳗弧菌MHK3株Hcp表达和杀菌能力的影响

溶血素共调节蛋白(Hcp)的合成和分泌是六型分泌系统(T6SS)行使功能的重要特征。RNA聚合酶的σ亚基RpoS参与调节细菌的生长和应激反应。为了探究RpoS对鳗弧菌(Vibrio anguillarum) T6SS的调控作用,本研究构建了MHK3?rpoS突变株,检测了部分表型特征的变化;利用lacZ半乳糖苷酶报告基因检测了突变株hcp1和hcp2在转录水平的变化;进行Western blot并定量分析突变株Hcp在翻译水平的变化;并通过细菌拮抗实验检测了突变株杀菌能力的变化。结果显示,MHK3?rpoS突变株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性与MHK3野生株相比无显著差异(P>0.05),而平台早期的菌膜形成能力有显著上升(P<0.05);在各生长时期,MHK3?rpoS的hcp1和hcp2在转录水平的表达量均较MHK3有显著上升(P<0.01),最高时分别为MHK3的1.79倍和1.94倍;在翻译水平上,MHK3?rpoS在胞内和胞外Hcp的分泌均有显著升高(P<0.05),最高时分别为MHK3的1.59倍和1.31倍;同时,MHK3?rpoS对大肠杆菌(Escherichia coli) E5的杀菌能力约为MHK3的1%。研究表明,rpoS对鳗弧菌MHK3株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性均无显著调控作用,但对平台早期的菌膜形成能力具有一定的负调控作用,在转录和翻译水平上也负调控Hcp的表达。而在杀菌能力上,rpoS发挥一定的正调控作用。说明菌株的杀菌能力强弱并非直接与Hcp的表达和分泌量正相关。本研究为进一步阐明T6SS的调控机制及其介导的杀菌作用机制提供了新思路,并丰富了其理论基础。     

溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用Overlap PCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE（kdpDE）基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7 d后,鱼体内不能检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该减毒活疫苗及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%,浸泡免疫组次之（66.7%）;同时,该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%,浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的候选减毒活疫苗。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的 病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD50为2.07×106 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V. rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

不同密度青蛤养殖塘异养细菌和弧菌的数量变化

研究了青蛤(Cyclina sinensis)养殖环境中异养细菌数量和弧菌数量的动态变化,以探讨其与养殖密度的相关性和样本间相关性。结果表明:实验周期内各养殖塘水体中异养细菌总数呈现不同的变化趋势且差异不显著(P>0.05),而弧菌数量变化趋势较为一致,9月份与其他月份水样中弧菌数量差异较为显著(P<0.05)。各塘底泥中异养细菌总数变化和弧菌数量变化差异均不显著,而不同密度养殖塘底泥中弧菌数量变化差异显著(P<0.05)。不同采样时间同一塘的青蛤腔液异养细菌总数差异极显著(P<0.01),而弧菌数量差异较为显著(P<0.05)。样本间、样本与养殖密度间相关性分析发现,水体中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈显著正相关(r=0.335,P<0.05);底泥中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈正相关且相关性极显著(r=0.587,P<0.01);底泥和水体中异养细菌总数和弧菌数量变化与养殖密度相关性均不显著(P>0.05);青蛤腔液异养细菌总数变化与养殖密度相关性极显著(r=-0.189,P<0.01),弧菌数量变化与养殖密度相关性极显著(r=-0.123,P<0.01)。     

黄渤海区域贝类中副溶血弧菌污染调查及血清学分型

[目的]了解黄渤海区域零售贝类中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)污染及血清学分型情况,为指导安全消费和建立预警预报系统提供科学依据.[方法]2010年7~10月,采集山东日照、烟台、青岛、威海、大连和莱州6个城市零售市场上的贝类,利用MPN-PCR对样品进行检测和定量分析,采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析.[结果]153份样品中共检出Vp阳性115份,各城市检出率均在60.0%以上,平均为75.2%.经卡方检验显示:不同城市间的检出率无显著差异(P>0.05),不同贝类的检出率存在显著差异(P<0.05),其中螠蛏的检出率最高(100.0%).定量分析结果表明:MPN均值最高的是螠蛏(673.9 MPN/g),不同贝类中Vp的MPN平均值存在显著差异(P<0.05).血清学分型结果显示:贝类中Vp的血清型分布呈多样性,115株菌可鉴定出9个0群和53个K型.[结论]黄渤海区贝类中Vp检出率较高、分布广泛,且血清型具有多样性的特点,但未检出Vp的tdh基因.     

水产品中弧菌的PCR技术检测研究进展

水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌均是食源性致病菌,对这些菌种灵敏、快速的检测方法对水产品安全以及保护人类健康极为重要.主要综述了水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的分子生物学检测研究进展.     

拟态弧菌溶血素VMH蛋白B细胞线性表位的预测与鉴定

为了定位拟态弧菌热不稳定溶血素VMH蛋白的B细胞线性表位,以VMH蛋白全长氨基酸序列为基础,联合利用ABCpred和Bepi Pred网络服务器综合分析预测VMH蛋白B细胞线性表位。同时,以霍乱弧菌Cytolysin蛋白为同源建模模板,利用Modeller 9.14软件构建VMH蛋白的3D结构,并使用Py Mol软件展示预测表位,确定其在3D结构中的位置。共预测出6个最有可能的B细胞线性表位,它们分别位于VMH蛋白N端P130-141、P192-203、P236-247、P281-292、P425-436和P464-475区域,且完全或大部分暴露于蛋白3D结构表面。人工合成6条预测表位肽,分别采用肽ELISA、肽抑制性免疫印迹反应和溶血活性试验进行鉴定。结果发现6个预测表位肽均能与兔抗VMH蛋白抗体发生结合反应;除预测表位P281-292外,其余5个预测表位肽能明显抑制兔抗VMH蛋白抗体与VMH蛋白间的免疫印迹反应,且具有溶血活性。结果表明,预测表位P130-141、P192-203、P236-247、P425-436和P464-475是拟态弧菌VMH蛋白的真正B细胞线性表位。     

哈维氏弧菌的主要致病因子及其特性分析

从大黄鱼致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1株提取外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和胞外产物(ECP),并进行毒性实验,以研究哈维氏弧菌的主要致病因子及其特征.结果表明:OMP、LPS致病性较弱,而ECP可导致鱼死亡,初步得出哈维氏弧菌GYC1108-1株的主要致病因子为胞外产物,其对鱼的半数致死量(LD50)为3.5 μg·g-1;该蛋白酶与底物偶氮酪蛋白(azocasein)作用的最适pH为8.0,最适温度28℃,对热敏感,分子质量为55 ku;该酶活性被碘乙酸抑制,也被SDS和HgCl2完全抑制,PMSF和ZnCl2能部分抑制该蛋白酶活性,而CuCl2、CaCl2、MgCl2对该酶活性影响不大,2-巯基乙醇、DTT、L-半胱氨酸、EDTA和EGTA对该酶活性有促进作用,表明其为半胱氨酸蛋白酶;研究发现ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和脂肪酶活性,无脲酶活性;免疫印迹结果发现GYC1108-1的ECP能与大黄鱼抗GYC1108-1血清发生免疫发应,分子质量为55 ku的半胱氨酸蛋白酶是具有免疫原性的物质.