虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌.为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带.以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1 ×102cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL.试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌.     

副溶血性弧菌分子检测与分型研究进展

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌,常通过食用被该菌污染的食品导致食物中毒。该文综述了副溶血性弧菌的分子检测技术如PCR、环介导等温扩增、免疫捕获等,及分型技术如RAPD-PCR、ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型、RFLP等,这些方法将为副溶血性弧菌食物中毒提供重要的检测与分型手段,对预防与控制副溶血性弧菌食物中毒具有重要意义。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

溶藻弧菌感染对剑尾鱼HSP70基因表达的影响

用溶藻弧菌Vibrio alginolyticus感染剑尾鱼Xiphophorus helleri,取感染后第0、2、5、8、11 d的活鱼及感染后第2 d濒死鱼,采用半定量RT-PCR方法分别检测HSP70基因在肝胰脏、脾脏、头肾和心脏组织中的表达。结果表明:正常条件下,HSP70在检测的剑尾鱼组织中均不表达;在用溶藻弧菌感染第8 d的剑尾鱼肝胰脏内,HSP70基因被诱导强烈表达,HSP70/β-actin的值为1.80±0.03;在感染第2、5 d的剑尾鱼头肾内,HSP70基因被诱导表达,第8 d HSP70基因强烈表达,感染濒死鱼头肾内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.35±0.02、0.15±0.01、2.00±0.06和0.95±0.05;在剑尾鱼被感染第2、5、8 d,在脾脏内均检测到HSP70基因的表达,感染濒死鱼脾脏内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.30±0.02、0.15±0.01、0.45±0.03和1.55±0.04;仅在感染濒死鱼的心脏中检测到HSP70基因的表达,HSP70/β-actin的值为0.30±0.02;到第11 d HSP70基因表达消失。     

对硫磷与敌百虫对发光菌的联合毒性效应

研究了对硫磷和敌百虫对发光菌的单一毒性及以毒性单位1∶1、1∶44、∶1配比的二元混合物的联合毒性,并且对联合毒性进行评价。结果表明,采用毒性单位法(TU)、相加指数法(AI)、相似性参数(λ)得出二元混合物的联合作用均为拮抗作用,混合毒性指数法(MTI)与前3种方法的评价结果略有不同。     

水生动物源嗜芳香环弧菌的鉴定及耐药性分析

本研究从患病的半滑舌鳎分离得到5株弧菌,对其进行种属鉴定,并研究其耐药性及分子水平耐药机制。采用生化检测方法和分子生物学方法(基因16S rRNA、HSP60和mreB)进行鉴定,结果显示,5株弧菌均为嗜芳香环弧菌。通过肉汤稀释法检测菌株对抗菌药物的耐药性,通过PCR扩增和测序技术检测菌株中耐药基因和4类整合子并对其携带基因盒进行分析。结果显示,5株嗜芳香环弧菌均对环丙沙星、链霉素、红霉素、氟苯尼考、氨苄西林、磺胺甲恶唑、复方新诺明和利福平耐药,且均携带qnr VC、bla CARB-17、strA、strB和sul耐药基因。此外,菌株JS291和JS295携带Ⅰ类整合子、qacEΔ1和sul1耐药基因;可变区携带基因盒分别为dfr16-aad A2和arr-3-dfr A27。5株嗜芳香环弧菌为多重耐药菌株,且多重耐药表型与耐药基因密切相关。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD₅₀为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70?90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式。结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低。鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达。鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达。其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调。用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达。研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程。本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制。     

养殖大黄鱼溶藻酸弧菌病病原菌传染途径的研究

从养殖大黄鱼病鱼的肝脏和脾脏内分离、纯化到溶藻酸弧菌，经回归感染试验证实它是该病的致病菌。使用法国生物一梅里埃公司生产的自动细菌鉴定仪(ATB)进行细菌鉴定，该菌株的生理生化特性符合溶藻酸弧菌的特性。研究结果表明，养殖大黄鱼溶藻酸弧菌病病原菌传染途径，主要是从水经伤口传染到体内，在试验条件下传染率为60％。病原菌在30℃时生长很快，20℃时生长慢，10℃时基本不生长，对氟苯尼考、四环素和乙酰螺旋霉素等7种药物敏感。     

河流弧菌在天然海水与人工海水中的饥饿效应

对数生长期河流弧菌分别悬浮于天然海水和人工海水后于28℃进行饥饿试验.在饥饿初期,两种海水中河流弧菌的总菌数、活菌数、菌落形成单位数都明显上升,但天然海水中的河流弧菌生长时间持续更久、增长幅度也更大;饥饿中、后期,总菌数都保持稳定,而可培养菌数与活菌数逐渐下降,其中可培养菌数下降幅度高于活菌数,人工海水中的河流弧菌下降幅度高于天然海水.河流弧菌对青石斑鱼表皮粘液的粘附量随着饥饿时间延长先上升后下降.与对数生长期相比,饥饿60 d的可培养细胞对热和紫外线的耐受性提高.饥饿细胞的间接ELISA最低检测限高于对数生长期细胞.通过SDS-PAGE分析菌体蛋白发现饥饿细胞的蛋白质条带减少.腹腔注射饥饿60 d的河流弧菌不会引起小鼠死亡,而对数生长期细胞能够引起小鼠死亡.研究结果表明,河流弧菌能够在温暖的人工海水和天然海水中长时间饥饿存活,但是饥饿细胞的毒力较低.