棉花CRVW的克隆与抗黄萎病功能分析

目的 黄萎病（Verticillium wilt）是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质。棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW（cotton resistance to Verticillium wilt）进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础。方法 根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉（Gossypium hirsutum）农大601（ND601）中CRVW的开放读码框（open reading frame,ORF）。利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件。构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置。利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸（salicylic acid,SA）诱导处理条件下的表达模式。构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能。检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路。结果 从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50%不规则卷曲、17.76% α-螺旋、11.20%延伸链和1.54% β-卷曲。综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质。CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高。CRVW的ORF上游序列（CRVW-P）中包括响应乙烯（ethylene）、SA、生长素（auxin）和脱落酸（abscisic acid）等4种激素信号的顺式作用元件。另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件。SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达。黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号（CCRI8）中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后。黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照（CK）组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症。进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性。沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1（isochorismate synthase 1）、EDS1（enhanced disease susceptibility 1）、PAD4（phytoalexin deficient 4）、NPR1（nonexpresser of PR gene 1）和PR1（pathogenesis-related protein 1）等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达。结论 CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程。     

生防放线菌SC1 1菌剂的研制

以放线菌SC1-1为研究对象,优化该菌株的发酵条件和生产工艺,测定其对茄子黄萎病的温室防治效果。结果表明,该菌株最佳固态发酵工艺为基质(大米粉)中加入玉米秸秆60 mg/g和小米粉30 mg/g,发酵条件为接种量0.4 mL/g、初始含水量400 mg/g、培养时间192 h、初始pH7.6。对茄子黄萎病的防效达到64%,高于对照多菌灵处理。     

芙蓉葵的黄萎病抗性鉴定

为挖掘抗棉花黄萎病菌新种质,进而为棉花抗黄萎病育种提供有益基因资源。以芙蓉葵(Hibiscus moscheutos L.)、‘中棉所8号’和Pima90-53为材料,采用蛭石育苗和无菌育苗2种方法,对其黄萎病抗性进行了鉴定。结果表明,采用蛭石育苗,芙蓉葵表现出高抗黄萎病,病情指数为7.69,其抗性优于抗病的海岛棉品种Pima90-53。陆地棉品种‘中棉所8号’表现出感病性状。采用无菌育苗,芙蓉葵黄萎病抗性优于海岛棉品种Pima90-53。2种抗性鉴定方法中,均不能从接菌培养的芙蓉葵分离出黄萎病菌。说明芙蓉葵具有高抗棉花黄萎病的特性。     

北京萝卜萎蔫病病原鉴定及病原生长影响因子

2009年北京郊区发生一种萝卜(Raphanus sativus L.)新病害,其主要症状表现是叶子黄化萎蔫,生长受阻。针对该病的发生,作者采集典型发病植株进行病原菌的分离纯化,用传统的形态学方法和rDNA-ITS序列分析方法进行病原鉴定,并进一步对病原菌生长影响因子进行研究,以便为该病的进一步深入研究、抗病种质资源的筛选和抗病品种的选育打下基础。研究认为该病由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起。该病原菌生长适宜温度为20~25℃,适宜pH为6~8,该病原菌能够很好地利用多种氮源和碳源,氮源以硫酸铵最为适宜,碳源则已可溶性淀粉最适宜。这是首次报道由大丽轮枝菌侵染引起的萝卜黄萎病在中国的发生。     

向日葵黄萎病菌生物学特性及致病性研究

[目的]明确新疆向日葵黄萎病病原菌种类,分析病害规律,研究防病关键技术.[方法]采用形态分类方法对病原菌进行种的鉴定,采用一般生物学方法对病原菌重要生物学特性及致病性进行研究.[结果]病原菌种的鉴定结果表明,新疆向日葵黄萎病主要致病菌为大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)和硫色轮枝菌(Verticillum sulphurellum);病原菌生物学特性研究表明:两种病原菌的生长周期及温度适应性基本一致,生长周期约为10 d,病菌生长温度范围为10～ 30℃,最适生长温度为25℃,致死温度为52C;大丽轮枝菌较适宜的酸碱范围为pH5.1～11.1;硫色轮枝菌在pH4.1 ～11.1均可生长;在多种常用培养基中,燕麦培养基是大丽轮枝菌的最适培养基;而玉米片培养基是硫色轮枝菌的最适培养基.致病性研究表明:自然条件下,病菌自苗期开始整个生育期均可侵染;人工接种条件下,高湿及有伤接种有利于侵染和发病.[结论]新疆向日葵黄萎病的主要病原菌为大丽轮枝菌和硫色轮枝菌,两种病原菌对向日葵均有较强的致病性.     

新疆棉花黄萎病抗性鉴定与评价

[目的]对新疆生产上主栽以及参加生产示范的棉花品种(系)的黄萎病抗性进行鉴定,为棉花生产提供指导.[方法]利用发病均匀的自然病圃对棉花品种的黄萎病抗性进行鉴定.[结果]通过对南、北部棉区的主栽以及参加生产示范及常规区试的120份棉花品种黄萎病抗性鉴定发现,抗黄萎病的棉花品种较少,主要以耐黄萎病和感黄萎病品种为主.只鉴定出一个抗黄萎病品种01 -2,其病情指数较高为20.0,达到抗病与耐病的临界值.耐黄萎病品种较多占到44.2;,包括81-3等种植多年的老品种.[结论]目前新疆棉花以耐黄萎病品种为主,缺乏抗黄萎病品种,亟需培育新的抗病品种.     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

棉花抗黄萎病QTL定位研究进展

QTL(quantitative trait locus)定位将控制数量性状的基因分解成单个孟德尔因子进行详细剖析,更为细致地了解数量性状的遗传规律,为加速棉花抗黄萎病的遗传改良奠定基础。本文概述了棉花抗黄萎病QTL定位理论和现状,讨论了棉花抗黄萎病QTL定位过程中存在的问题及在遗传改良上的应用前景。     

棉花黄萎病生防内生细菌Jaas cd的鉴定及田间防效

对棉花黄萎病生防内生细菌Jaas cd(原名73a)进行了菌种鉴定和田间应用方式的改进。抑菌谱测定结果表明,该菌株对12种病原真菌均有较强的抑制作用。通过形态观察、生理生化鉴定、Biolog鉴定以及16S rD-NA序列比对,证明该菌株为多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。菌株Jaas cd的16S rDNA序列与多黏类芽孢杆菌(AM062684)的相似性为99.7%,GenBank登录号为AY942618。田间大区示范试验结果表明,用菌株Jaascd的发酵液在棉苗移栽前喷施棉苗和移栽时灌根2种方式处理,都能有效防治棉花黄萎病和提高棉花产量,但移栽前喷施棉苗操作更加简便易行。     

商丘地区棉花黄萎菌的分离与鉴定

从河南商丘各县区采集棉花黄萎病病株,对其进行黄萎病菌的分离和鉴定。采用连续稀释法和单孢分离法分离得到16个单菌系,并以这些单菌系作为研究对象,利用真菌通用引物ITS1和ITS4对所分离的单菌系内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增,得到543 bp大小的片段,经过克隆测序和在GenBank中进行BLASTn分析,与安阳棉花黄萎菌的ITS序列的同源性均达到98%以上,证明了这些片段来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的ITS区。同时将这些序列在NCB I的GenBank进行了登记,获得5个登记号:FJ715500、FJ715501、FJ715502、FJ715503、FJ715504。