抗红鳍东方鲀盾纤毛虫药物的筛选及组织分布研究

为筛选出抗红鳍东方鲀盾纤毛虫的天然化合物,并评价其对红鳍东方鲀的安全性,选取了二十种中药有效成分,在光学显微镜下观察统计药物各浓度梯度在10 min、30 min和60 min时对盾纤毛虫的杀灭作用;选择杀虫效果最好的两种药物进行杀虫率检测,通过棋盘法进行联合用药评价;并使用高效液相色谱法研究两种药物在红鳍东方鲀体内的组织分布。结果表明：MNL、NHK两种化合物与盾纤毛虫作用10 min时,药物浓度为8 μg/mL可观察到杀虫作用,药物浓度达到32 μg/mL时杀虫作用显著,随着时间延长杀虫作用增加,但二者联用呈拮抗作用;MNL和NHK在红鳍东方鲀肌肉中达峰时间分别为0.75 h和1 h,在肝脏均呈现双峰现象且第一达峰时间为0.5 h,并分别于3 h和12 h在受检组织中消除。研究表明,即此两种天然化合物具有显著的杀虫作用,在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性,药物吸收快、达峰时间短、消除快,应用中宜单独用药不宜联用。     

河豚4SNc-Tudor蛋白的鉴定及生物信息分析

［目的］对河豚4SNc Tudor蛋白（SN4TDR）进行序列与结构相关的生物信息分析,为认识该蛋白结构与功能提供借鉴。［方法］应用双向电泳及基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI TOF MS）技术,从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白。并对其进行生物信息学分析。［结果］首次从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白SN4TDR。河豚SN4TDR定位于细胞质,无信号肽,为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点。蛋白SN4TDR存在α 螺旋、β 折叠和无规则卷曲结构,有一个可能形成跨膜结构的片段。并用同源建模的方法,预测了河豚SN4TDR的三维结构模型。［结论］分析河豚SN4TDR基因及蛋白结构,有助于进一步研究该蛋白及其基因的分子和生物学功能。     

暗纹东方鲀生长激素基因克隆与同源性分析

克隆获得暗纹东方鲀GH基因,该基因包含6个外显子和5个内含子,在此基础上获得其cDNA序列,共有591bp,编码196个氨基酸。将该cDNA序列转换成蛋白质序列后,结合NCBI数据库中得到的其它24种脊椎动物生长激素基因的蛋白质序列,运用MEGA3.1,以UPGMA法构建东方鲀等25种脊椎动物的生长激素基因进化树,14种鱼类中除了鳗鲡和鳝鱼外聚为一大类,其它动物中哺乳动物、反刍动物、家禽、爬行动物、人以及鳗鲡等聚为另一大类,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀生长激素基因的氨基酸同源性达到100%,与斗鱼、杜父鱼、金鲈生长激素基因的氨基酸同源性达到70%以上,与人的生长激素基因的氨基酸同源性也达到40%;斑马鱼、草鱼、鲋鱼以及鲤鱼之间生长激素基因的氨基酸同源性在85%以上;哺乳动物、反刍动物、家禽的生长激素基因的氨基酸同源性在90%左右。从进化树的结果来看,与传统分类学研究结果基本一致,为进一步研究GH基因在胚胎发育及个体生长中的功能奠定基础。     

暗纹东方鲀SRAP-PCR体系的建立与优化

以暗纹东方鲀基因组DNA为材料,利用正交设计L16(45)对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素(Mg2、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系为:20 μL的PCR体系中含有Mg2+ 1.5 mmol·L-1、Taq酶0.5U、模板DNA 75 ng、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1.利用30个暗纹东方纯样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠.     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

延迟排卵对红鳍东方鲀卵子质量的影响

为探究红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)延迟排卵对卵子生理生化变化及卵质的影响,人为对性成熟亲鱼推迟1~2周挤卵,并将未推迟挤卵组记为A组,推迟1周挤卵组记为B组,推迟2周挤卵组记为C组,研究推迟排卵后卵子内磷酸酶、苹果酸脱氢酶、唾液酸、总氨基酸以及脂肪酸含量等生化参数变化规律及延迟排卵与受精率的相关性。结果显示,推迟1周排卵后,B组受精率显著下降(P0.05),受精率由A组的86.66%降至57.14%;推迟2周后,C组受精率降至31.89%;卵内酸性磷酸酶活力随产卵期推迟而显著下降(P0.05),并与受精率存在显著正相关(P0.05,R~2=0.705);A组苹果酸脱氢酶活力显著高于B、C两组(P0.05,R~2=0.630),总氨基酸含量亦存在相似变化趋势,A、B组显著高于C组(P0.05,R~2=0.706);此外十四烷酸(C_(14:0))、十五烷酸(C_(15:0))、棕榈酸(C_(16:0))、棕榈油酸(C_(16:1n-7))、a-亚麻酸(C_(18:3n-3))、二十碳五烯酸(EPA)在总脂中比例均在正常组中最高,并与受精率存在显著正相关(P0.05),二十二碳五烯酸(C_(22:5n-3))、二十二碳六烯酸(DHA):二十碳五烯酸(EPA)均与受精率呈显著负相关(P0.05)。结果表明,卵子中磷酸酶、苹果酸脱氢酶、总氨基酸、脂肪酸含量与卵子活力存在相关性,在红鳍东方鲀人工授精时,在亲鱼卵子成熟后1周内进行人工挤卵最为适宜。     

双斑东方鲀精子冷冻保存方法探究

双斑东方鲀(Takifugu bimaculatus)在福建已形成较大规模的养殖产业,但其精卵成熟同步率低、自然交配受精率低等繁殖特点已成为养殖规模化发展的最大制约因素。而精子超低温冷冻保存技术作为直接保存细胞遗传物质的一种有效方法,为双斑东方鲀规模化人工繁育问题的解决提供了方案。研究以复苏后的精子活力为选择指标,开展双斑东方鲀精子冷冻保存方法的研究,对抗冻剂、基础液、精子稀释浓度和降温程序等几个关键影响因素进行了筛选,获得了双斑东方鲀精子的最适冷冻方法:以含5%二甲亚砜(DMSO)的MPRS溶液与精子按1∶1比例稀释,样品在4℃冰箱中平衡30 min,液氮上方10 cm处熏蒸5 min,再下降到5 cm处熏蒸5 min,之后投入液氮。按此方法保存的双斑东方鲀精子在解冻激活后,其活力可达(83±3)%,与相应卵子受精,可得到平均70%的孵化率,可以满足双斑东方鲀规模化人工繁育的需求。研究结果也可为其他东方鲀鱼类的相关研究提供参考。