暗纹东方纯线粒体COⅢ克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方纯线粒体基因组（mtDNA）含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ（COⅢ）及其下游70bp的tRNA^cly序列。COⅢ基因编码框包含786个核苷酸，编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类COⅢ的序列组成对A＋T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方奎屯与GenBank中8个目12种鱼类的COⅢ序列同源性比较，显示暗纹东方纯与这些鱼类的COⅢ基因具有较高的同源性。根据暗纹东方纯与纯目其他5种鱼的COⅢ基因序列所建立的进化树。与传统的分类地位相吻合。推定的tRNA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据COⅢ序列构建的分子进化树分析，认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时，应综合考虑物种遗传变异的特点。     

抗红鳍东方鲀盾纤毛虫药物的筛选及组织分布研究

为筛选出抗红鳍东方鲀盾纤毛虫的天然化合物,并评价其对红鳍东方鲀的安全性,选取了二十种中药有效成分,在光学显微镜下观察统计药物各浓度梯度在10 min、30 min和60 min时对盾纤毛虫的杀灭作用;选择杀虫效果最好的两种药物进行杀虫率检测,通过棋盘法进行联合用药评价;并使用高效液相色谱法研究两种药物在红鳍东方鲀体内的组织分布。结果表明：MNL、NHK两种化合物与盾纤毛虫作用10 min时,药物浓度为8 μg/mL可观察到杀虫作用,药物浓度达到32 μg/mL时杀虫作用显著,随着时间延长杀虫作用增加,但二者联用呈拮抗作用;MNL和NHK在红鳍东方鲀肌肉中达峰时间分别为0.75 h和1 h,在肝脏均呈现双峰现象且第一达峰时间为0.5 h,并分别于3 h和12 h在受检组织中消除。研究表明,即此两种天然化合物具有显著的杀虫作用,在一定范围内具有剂量依赖性和时间依赖性,药物吸收快、达峰时间短、消除快,应用中宜单独用药不宜联用。     

光唇鱼赤皮病病原研究

浙江新昌某养殖场的光唇鱼(Aerossocheilus fasciatus)爆发赤皮病,发生大量死亡,从患病鱼肝脏中分离到菌株GCL100301,通过人工感染试验,确定该菌株为病原。通过生理生化和分子生物学鉴定,该菌株GCL100301被鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。通过对该菌株的药物敏感试验,发现其对环丙沙星、新霉素敏感,对青霉素、复方新诺明、先锋V、新生霉素、痢特灵和头孢噻吩完全耐药。研究结果为光唇鱼病害防治提供了理论依据。     

河豚4SNc-Tudor蛋白的鉴定及生物信息分析

［目的］对河豚4SNc Tudor蛋白（SN4TDR）进行序列与结构相关的生物信息分析,为认识该蛋白结构与功能提供借鉴。［方法］应用双向电泳及基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI TOF MS）技术,从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白。并对其进行生物信息学分析。［结果］首次从河豚肝脏总蛋白中鉴定到河豚的4SNc Tudor结构域蛋白SN4TDR。河豚SN4TDR定位于细胞质,无信号肽,为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点。蛋白SN4TDR存在α 螺旋、β 折叠和无规则卷曲结构,有一个可能形成跨膜结构的片段。并用同源建模的方法,预测了河豚SN4TDR的三维结构模型。［结论］分析河豚SN4TDR基因及蛋白结构,有助于进一步研究该蛋白及其基因的分子和生物学功能。     

暗纹东方鲀生长激素基因克隆与同源性分析

克隆获得暗纹东方鲀GH基因,该基因包含6个外显子和5个内含子,在此基础上获得其cDNA序列,共有591bp,编码196个氨基酸。将该cDNA序列转换成蛋白质序列后,结合NCBI数据库中得到的其它24种脊椎动物生长激素基因的蛋白质序列,运用MEGA3.1,以UPGMA法构建东方鲀等25种脊椎动物的生长激素基因进化树,14种鱼类中除了鳗鲡和鳝鱼外聚为一大类,其它动物中哺乳动物、反刍动物、家禽、爬行动物、人以及鳗鲡等聚为另一大类,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀生长激素基因的氨基酸同源性达到100%,与斗鱼、杜父鱼、金鲈生长激素基因的氨基酸同源性达到70%以上,与人的生长激素基因的氨基酸同源性也达到40%;斑马鱼、草鱼、鲋鱼以及鲤鱼之间生长激素基因的氨基酸同源性在85%以上;哺乳动物、反刍动物、家禽的生长激素基因的氨基酸同源性在90%左右。从进化树的结果来看,与传统分类学研究结果基本一致,为进一步研究GH基因在胚胎发育及个体生长中的功能奠定基础。     

暗纹东方鲀SRAP-PCR体系的建立与优化

以暗纹东方鲀基因组DNA为材料,利用正交设计L16(45)对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素(Mg2、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系为:20 μL的PCR体系中含有Mg2+ 1.5 mmol·L-1、Taq酶0.5U、模板DNA 75 ng、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1.利用30个暗纹东方纯样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠.     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

黄山殷溪河光唇鱼食性特征的初步研究

基于2014年7月于黄山殷溪河采集的94尾光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)标本,初步研究了该物种的食性特点,分析了其食物组成及其多样性随年龄和全长增长的变化。渔获物的个体全长为17.93~357.72 mm,分为5个年龄组。光唇鱼的食物由陆生和水生植物、陆生昆虫、碎屑以及环节动物、软体动物、甲壳动物、水生昆虫等水生动物组成,其中以水生昆虫、水生植物和碎屑为常见和优势饵料种类。单因素相似性分析结果显示,1~3龄组间的食物类型数无显著差异,但食物多样性指数和宽度指数均存在显著差异。Pearson's相关分析结果显示,随个体全长增大,食物类型数显著增多而宽度指数显著下降,但食物多样性无显著变化。此外,冗余分析结果显示,光唇鱼的食物组成与个体全长显著相关;随个体全长增大,胃含物中水生昆虫类逐渐减少而甲壳类和陆生昆虫逐渐增多,但水生植物和碎屑的多度与全长无明显关系。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。