利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17

本研究采用杂交和分子标记辅助选择技术,将亲本材料P2的水稻广谱高抗稻瘟病基因Pi-9(t)导入杂交水稻恢复系泸恢17,再利用抗稻瘟病基因Pi-9(t)的特异分子标记pB8检测该目的基因,获得68份携有Pi-9(t)基因型的回交株系。基因型鉴定表明株系WR1023、WR1043、WR1056和WR1062为均含有Pi-9(t)基因纯合的回交后代株系。表型分析表明WR1023和WR1056株系农业性状已稳定,且其株叶型、抗稻瘟病及配合力较好,我们认为可以用作育种抗性亲本材料。     

大豆生物钟基因GmLNK1/2、GmRVE4/8和GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定

生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程,对提高作物产量具有重要的作用。LNK1(NIGHTLIGHTINDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4、AtRVE8和AtTOC1在大豆中的同源基因,通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。     

水稻(Oryza sativa)感光抑制基因Hybrid Rice Photoreceptor Suppressor Gene 1(HRPSG1)的定位与分析

为了发掘更多的水稻抽穗期调控基因,完善相关基因调控网络,本课题组在水稻品系‘神9A’中发现一个能够抑制感光的基因,暂命名为Hybrid Rice Photoreceptor Suppressor Gene 1(HRPSG1)。遗传分析表明该性状受一对隐性核基因调控。通过杂交不育系配组方法与分子标记技术将该基因定位于第10条染色体长臂中段SSR-15和SSR-21之间,遗传距离分别为0.022 cM和0.025 cM,物理距离为115 kb。通过测序发现LOC_Os10g32600的外显子有两处碱基的突变,因此初步认为LOC_Os10g32600就是‘神9A’中抑制感光的基因。荧光定量PCR结果显示,水稻抽穗期相关基因DTH8和HD1在‘神9A’中的表达量急剧下降,分别仅有‘Q6A’的0.34和0.26。该结果为下一步HRPSG1基因的功能分析提供了帮助。     

PRRSV强、弱毒株Nsp9基因对PRRSV复制的影响

为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,以MOI=1的剂量接种PRRSV XH-GD毒株,通过TCID50试验测定病毒的滴度,采用荧光定量PCR和Western Blot方法来测定病毒的N蛋白表达情况。结果表明,转染弱毒株CH-1R Nsp9基因的Marc-145细胞中,PRRSV的N蛋白在mRNA水平、蛋白质水平上的表达量均高于转染强毒株XH-GD组,且病毒的滴度也显著高于转染强毒株XH-GD组。综上,在Marc-145细胞中,弱毒株CH-1R Nsp9基因对PRRSV复制的促进作用优于强毒株XH-GD。     

稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。     

MDT6.0与INVENTOR9巧妙结合进行动力头虚拟设计

阐述了虚拟设计技术的基本理论,介绍了MDT6.0与INVENTOR9两种三维设计软件在旋挖钻动力头设计中的应用,论述了两种软件建模及巧妙结合的过程。     

含山梨醇的新型生物有机肥促生效应与机理研究

向含解淀粉芽孢杆菌SQR9的生物有机肥中添加山梨醇研制了新型生物有机肥,并通过黄瓜盆栽和拟南芥培养试验研究了该新型生物有机肥的促生效应与机理。结果表明,含解淀粉芽孢杆菌SQR9的生物有机肥对黄瓜具有显著促生效果,添加山梨醇有利于促进解淀粉芽孢杆菌SQR9在土壤中定殖,能进一步提高生物有机肥的促生效应。施用该新型生物有机肥能显著提高土壤中速效养分的含量以及黄瓜对养分的吸收。山梨醇能有效促进菌株SQR9分泌生长素（吲哚乙酸,IAA）,进而促进野生型拟南芥根系的生长,而在使用IAA不敏感突变体时促生效果消失,说明山梨醇促进有益菌SQR9分泌IAA是该新型生物有机肥显著促进作物生长的机理之一。本研究提出了新型生物有机肥研发的新思路,为植物促生菌新应用模式的开发提供了理论依据。     

甘蓝花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因BoMF9的克隆与特征分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF9的全长序列设计引物，通过PCR直接扩增的方法从结球甘蓝（Brassica. oleracea var. capitata）和芥蓝（B. oleracea var. alboglabra）中克隆得到BcMF9的同源基因BoMF9（BoMF9c和BoMF9l）。生物信息学分析和系统树构建发现BoMF9c和BoMF9l具有花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因的序列特征。不同组织的表达特征分析发现它们分别在结球甘蓝和芥蓝的花蕾中特异表达。推测BoMF9c和BoMF9l可能在花粉萌发和花粉管伸长中起作用。     

Plasma matrix metalloproteinase‐9 activity in cats with lymphoma

In this study, plasma MMP‐9 activity was evaluated in cats with lymphoma. Plasma samples were obtained from 26 cats with lymphoma before treatment. From 13 of the included 26 cats, plasma samples were obtained 4 weeks after the initiation of treatment. Plasma samples were also obtained from 10 healthy cats as a control. Plasma MMP‐9 activity was examined by gelatin zymography and semi‐quantitative value (arbitrary unit; a.u.) for each sample was calculated. Relatively high levels of MMP‐9 were observed in cats with lymphoma compared with those in healthy control cats. MMP‐9 quantification through zymography showed significantly higher activity in cats with lymphoma (median, 0.63 a.u.; range, 0.23–3.24 a.u.) than in healthy controls (0.22 a.u.; 0.12–0.46 a.u.; P < 0.01). MMP‐9 activities were significantly different before (0.73 a.u.; 0.30–3.24 a.u.) and after treatment (0.50 a.u.; 0.14–1.32 a.u.; P = 0.017). Measuring plasma MMP‐9 activity in cats with lymphoma may become an appropriate monitoring tool for feline lymphoma.