菊花‘金不凋’再生及遗传转化体系的构建

‘金不凋’属于典型的日中性菊花,可作为日中性菊花开花分子机理的理想研究材料,目前尚未建立‘金不凋’的再生及遗传转化体系。本研究以‘金不凋’叶片为外植体,分别对影响再生及转化体系的主要因素进行试验。结果表明‘:金不凋’叶盘愈伤组织的不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,不定芽分化率为90.0%,平均再生不定芽数达5.5556个;相关性分析表明褐化率与愈伤诱导率以及平均再生愈伤组织数之间存在显著的负相关关系;试管苗最佳生根培养基为MS,生根率为100%。在‘金不凋’再生体系建立的基础上,初步建立了其遗传转化体系:‘金不凋’叶盘经过24 h预培养,在菌液浓度OD600=0.6的农杆菌中侵染10 min,共培养2 d,延迟培养5 d,叶片不定芽分化潮霉素临界浓度为2 mg/L,生根筛选潮霉素临界浓度为5 mg/L时,转化效率最高。通过潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得3株PCR阳性菊花苗,转基因阳性苗频率为2.5%,本研究为‘金不凋’的基因工程育种提供了技术基础。     

农杆菌介导转化甜菜影响因素的研究

[目的]以甜菜无菌苗的叶柄为外植体材料,对农杆菌转化条件和方法进行较为系统地比较研究,以期建立一种转化频率高、稳定性好、通用性较强的甜菜遗传转化技术体系.[方法]对影响农杆菌介导的不同因素分别进行比较试验.[结果]对甜菜叶柄进行培养后用不同菌液浓度OD600=0.3～0.4的农杆菌感染8～10 min,脱菌处理后接入卡那霉素浓度为100 mg/L、头孢霉素浓度为500 mg/L的选择培养基中进行筛选,获得的抗性芽较多,抗性芽分化频率可达到34.3;.[结论]初步建立了一种转化频率高、稳定性好、通用性较强的甜菜遗传转化技术体系,通过植物转基因技术为选育高产、优质、广谱抗病的甜菜品种奠定基础.     

超声波辅助对农杆菌介导“美人指”葡萄遗传转化中GUS瞬时表达的影响

通过超声波辅助农杆菌介导法,优化"美人指"葡萄遗传转化体系。利用GUS瞬时表达的方法研究了不同功率、时间条件下的超声波处理,外植体类型以及AS浓度对"美人指"葡萄遗传转化效率的影响。结果表明:外植体茎段在含75mg/L AS农杆菌悬浮液中侵染4 min,并在此期间,用功率为90 W的超声波处理14 s,获得最佳GUS瞬时表达率42.8%。     

农杆菌介导籼稻遗传转化研究的进展及策略

近年来,农杆菌介导法转化技术已广泛应用于粳稻遗传转化中。但是对籼稻遗传转化相对困难,由于水稻两个亚种遗传差异大,籼稻对转化反应的基因型依赖性强,愈伤组织诱导及分化率低。本文扼要回顾了农杆菌介导籼稻转化研究的历程,系统介绍了影响籼稻转化的主要因素,分析了农杆菌介导籼稻遗传转化研究中存在的问题,并提出了提高农杆菌介导籼稻遗转化效率的对策。高效籼稻转化体系的建立可以加速水稻转基因品种改良育种进程,推进水稻功能基因组研究的开展。     

农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术流程及操作要点

大豆遗传转化效率低,是大豆转基因育种亟待解决的重要问题。以大豆子叶节为外植体采用农杆菌介导法,系统地研究了大豆子叶节遗传转化各技术环节的操作要点,包括工程菌液制备、无菌苗获得及外植体制备、农杆菌的侵染及共培养、不定芽诱导、不定芽伸长、根诱导、驯化与移栽、抗性植株的获得及转基因植株的检测等,建立了一套较稳定、高效的大豆子叶节遗传转化体系。并利用该体系,将野生大豆耐盐碱相关基因A1对大豆品种绥农28、合丰50、合丰55、东农50进行遗传转化,系统地探讨了大豆基因型、影响T-DNA的转移效率的各环节、筛选剂浓度及不同基因型转化效率等几个重要因素。     

十二个小麦新品种成熟胚再生性能与农杆菌侵染敏感性评价

小麦成熟胚培养再生率比较低,尤其对优良小麦品种成熟胚再生性和农杆菌侵染敏感性还缺乏研究,一定程度阻碍了转基因小麦有效开展和产业化进程。以扬麦18、扬麦15、扬麦16、新冬18、小偃166和周麦22等12个优良小麦新品种为材料,研究了其成熟胚再生率及其对农杆菌侵染的敏感性。结果表明,12个小麦新品种成熟胚再生率0~35.3%,周麦27最高,扬麦19次之（27.9%）,新冬18、石麦B07-4056分别为211%和20.0%,其余品种再生率均低于20.0%;12个小麦品种成熟胚愈伤组织农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率0~33.3%,周麦18最高,扬麦15次之（23.8%）,扬麦18、周麦22、周麦27和石麦B07-4056虽有表达但频率较低（6.7%~9.1%）,其余品种没有观察到GUS基因瞬间表达。认为周麦27、扬麦19等品种适合进行成熟胚培养,周麦18、扬麦15等品种成熟胚适合进行农杆菌转化。优良小麦品种成熟胚再生性能和农杆菌敏感性评价为进一步利用细胞工程和基因工程途径改良小麦奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。     

农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究

以类原球茎体为受体材料,利用农杆菌EHA101(pIG121 Hm)介导转移GUS基因到石斛兰-蝴蝶兰的2个杂交品种。以一种β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择,获得了潮霉素抗性体,并通过X-gluc组织化学染色法,检测到较强的GUS的表达,表达率达80%以上。经过80 d的选择培养后在81个潮霉素抗性组织中获得了22株再生兰花。对其中的9株PCR阳性的再生植株进行Northern分析,检测到较强的GUS基因表达。     

海滨雀稗以hpt与bar基因为筛选标记的转化体系比较研究

海滨雀稗作为耐盐性较强的暖季型草坪草,具有极大的应用潜力。为建立高效稳定的海滨雀稗遗传转化体系,本研究以海滨雀稗成熟种子为外植体,确定了筛选剂潮霉素和草丁膦在海滨雀稗的愈伤组织继代培养和再生阶段的最佳筛选压。在进一步优化遗传转化条件的基础上,比较了以hpt与bar基因作为转基因筛选标记对海滨雀稗农杆菌介导的遗传转化效率的影响。结果表明：愈伤组织的再生率在继代36周后显著下降,继代48周的最高再生率为67.9%。潮霉素的最佳筛选压在继代培养阶段为120 mg·L^-1,再生阶段为80 mg·L^-1。草丁膦的最佳筛选压均为1.2 mg·L^-1。选取继代24周的愈伤组织用于农杆菌介导的遗传转化,最佳的转化条件为菌液浓度OD600=0.6,添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77,并辅以超声波处理20 min或真空处理10 min,浸染30min后共培养2 d。通过多次抗性愈伤组织和抗性再生苗的筛选,2种载体均获得了转基因再生植株。通过PCR检测证明hpt和bar基因分别成功在...     

农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。