抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

CYcD2基因转入丽格海棠研究

[目的]改变丽格海棠的开花时间,为丽格海棠分子育种奠定基础。[方法]以丽格海棠叶片为外植体,利用液氮直接转化法将pBI121-CYcD2转入根癌农杆菌EHA52中,再通过农杆菌介导法将CYcD2基因导入丽格海棠中。[结果]选择100 mg/L的卡那霉素作为转化外植体的起始选择压力。将经农杆菌共培养及过渡培养后的材料转入筛选培养基中,60 d后获得15个不定芽,再在生根培养基中培养20 d后,全部生根。PCR检测发现,15株卡那霉素抗性植株中有6株表现出与阳性对照相同的特异性条带,剩余植株为假转化体。Southern杂交分析表明6个转化植株中有5个出现了杂交信号,即为转基因植株,仅有1个为假阳性。[结论]该研究已成功地将外源基因CYcD2转入丽格海棠受体中。     

大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

番茄RBX1基因的功能初探

E3泛素连接酶是泛素蛋白酶体途径中非常重要的蛋白复合体,而大部分的E3连接酶都以Cullin蛋白作为支架,所有基于Cullin蛋白的 E3 连接酶都含有一个催化亚基RBX1。RBX1对于E3复合体结合E2和Cullin蛋白的活化具有重要作用。利用酵母双杂交技术鉴定出番茄RBX1蛋白与番茄CUL4蛋白有直接的相互作用。通过荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析野生型番茄中RBX1基因的组织特异性,结果显示RBX1基因在番茄各组织中均有表达,但在花与果实中表达量较高,茎和叶中相对较少。同时构建植物过量表达载体 PBI121-35S-RBX1并转化番茄,获得 3 株过量表达和 3 株RBX1共抑制转基因植株。研究发现共抑制的转基因植株表现出叶片变大、顶端优势变弱和不育等表型,说明RBX1基因在番茄的生长发育中发挥重要作用,推测植物RBX1基因可能与生长素和油菜素内酯等植物激素应答以及细胞增殖有关,为进一步研究该基因在植物中的生物学功能提供了线索。     

水稻合系41农杆菌介导转化体系的建立

研究建立了以云南水稻栽培粳稻良种合系41为主要目标的高效农杆菌介导转化体系。并获得28株转基因植株,转化率高达27.2%。GUS组织化学检测和分子生物学鉴定的结果提供了转化成功的有力证据。     

农杆菌介导法将bFGF基因转入木立芦荟的初步研究

利用农杆菌介导法将bFGF基因导入木立芦荟中,通过对农杆菌介导芦荟遗传转化影响因素的分析,建立了优化的芦荟转化体系.用继代培养获得的粗壮的芦荟单株茎段作为转化外植体,以OD=0.55～0.68的EHA105农杆菌工程菌液侵染25min,在MS+蔗糖10g/L+100～mol/L乙酰丁香酮的共体培养基上培养3d,在MS+...     

农杆菌介导的番茄遗传转化体系优化研究

    研究不同的番茄基因型、培养基类型、苗龄、外植体类型、植物表达载体和选择系统等对番茄再生和遗传转化效率的影响.结果表明,7 d苗龄的子叶或13 d苗龄的下胚轴,预培养2 d,侵染20 min,培养基中添加适宜浓度的玉米素(1.0～2.0 mg·L-1)和IAA(0.1～0.2 mg·L-1),以75～100 mg·L-1的卡那霉素筛选,番茄的转化频率最高,分别为51.4%和37.5%.且以卡那霉素抗性基因为筛选标记的质粒p2301 和pBI121作为植物表达载体,其转化频率高于以潮霉素抗性基因为筛选标记的植物表达载体p1301.     

农杆菌介导三价融合基因Rirol转化八棱海棠的研究

研究了以口蹄疫病毒FMDV 2A序列融合多基因在八棱海棠遗传转化上的应用,将DREB,IRT1和rolC融合三价基因(Rirol)通过农杆菌介导法转化八棱海棠,获得了一批nptⅡ抗性植株,经报告基因检测、PCR和Southern杂交分析证明融合基因成功导入到八棱海棠中。对转基因八棱海棠相关性状分析表明,转基因八棱海棠比对照具有较强的耐盐性,在表型上,表现节间缩短,分枝性强,侧根发达,证明外源融合基因在转基因植株中得到表达。试验初步证明了利用FMDV 2A序列进行多基因转化八棱海棠的可行性,为苹果等果树多基因转化提供了新的思路和途径。     

农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立

以普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)叶片为试验材料,接种于含不同激素浓度配比的MS培养基上进行愈伤组织、芽分化以及根再生的诱导,分析了不同激素浓度及其配比对愈伤组织诱导和芽分化以及根再生效果的影响。以已经建立的再生体系为基础,以农杆菌菌株LBA4404(含质粒pBin438-TaNHX2)侵染转化普那菊苣,探索普那菊苣高效遗传转化体系。结果表明:对外植体适宜的预培养时间为2～3d,与农杆菌的共培养时间也应控制在2～3d;侵染时间控制在8min左右;卡那霉素(Km)阳性筛选的适宜选择浓度为60mg·L^-1。乙酰丁香酮(AS)200μmol·L^-1是促进农杆菌转化的最佳浓度,200 W超声波处理、20次负压处理也可提高农杆菌转化率效果。26mg·L^-1 Km是野生型普那菊苣苗能够存活的上限,头孢唑林钠和头孢噻肟钠在500～1000mg·L^-1浓度范围内、羧苄青霉素300mg·L^-1和氨苄青霉素在40～60mg·L^-1浓度范围内均能较好的诱导出愈伤组织和芽。将来自小麦(Triticum aestivum)的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(vacuolar Na⁺/H⁺exchanger or antiporter,简称NHX,NHE或NHA)导入普那菊苣;经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。     

土壤中盾壳霉双标记平板计数法的建立及应用

盾壳霉是一种重要的生防菌,其在土壤中的存活数量直接关系到防治病害的效果。然而目前没有对土壤中盾壳霉直接计数的方法,构建一种简单易行的土壤中盾壳霉计数方法对研究盾壳霉在土壤中的存活动态具有重要意义。本研究利用农杆菌转化法构建了潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因标记的双标记盾壳霉菌株,并测定转化子的生长速度、产孢量和菌核致腐能力,初步分析了该方法计数土壤盾壳霉的有效性和可行性。结果显示,潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因可以稳定地遗传和表达,并且部分转化子生长速度、产孢量和菌核致腐能力与出发盾壳霉菌株JNCM没有显著差异。加入土壤中的盾壳霉转化子可以在含潮霉素(50μg/mL)、氯霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的PDA平板培养,杂菌得到充分抑制,呈现绿色荧光的盾壳霉转化子被有效检出,检出限达到2×103个/g土。本研究所构建的计数方法能有效检出施入土壤中的盾壳霉并进行活菌计数,可以用于盾壳霉JN-CM产品在土壤中的定殖、生长、繁殖和存活情况的研究。应用双标记平板计数法研究了不同温度、湿度、接种量和添加菌核等条件下盾壳霉JN-CM在土壤中的存活规律。结果显示,在含有核盘菌菌核的土壤中,盾壳霉JN-CM可以通过重寄生维持一段时间(12周)的数量增长,在长达半年左右(24周)的时间里其存活率仍然可以维持在65%左右。在不含菌核的土壤中,在一般土壤温度(10~20℃)范围内,无论土壤水分含量高低,其半年存活率也可以维持在50%左右。因此,可以预测,连续施用盾壳霉JN-CM生防制剂,可以使其数量在土壤中长期维持在一定的水平范围,达到长效防治效果。