在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

基于蛋白质反式剪接在大肠杆菌中表达鲎C因子CES多肽

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶原,可替代鲎试剂用于内毒素检测。鲎C因子N端Cys—EGF．sushil—sushi2（CES）片段中的sushil区域是与内毒素结合的关键部位。本研究在sushil结构域中的特定位点断开CES与内毒素结合的功能片段,然后分别和蛋白质内含肽SspDnaX的N端片段（IN）和C端片段0C）连接,并在大肠杆菌中表达,表达产物经亲和层析纯化、复性以及内毒素去除后,利用蛋白质反式剪接系统,在体外诱导该蛋白质内含肽发生剪接,重新得到C因子的CES蛋白,并检测其活性。实验结果表明此重组CES蛋白具有结合内毒素活性,提示在大肠杆菌系统中开发低成本内毒素检测试剂的可行性。     

不同尺寸蒸渗仪测定作物蒸散的田间试验研究

称重式蒸渗仪测定作物蒸散量（ET）是公认的一种标准测定方法。大型称重式蒸渗仪因单点独立安装而无法进行不同处理的重复试验,小型蒸渗仪则可解决该问题,但目前对于小尺寸蒸渗仪的适用性尚无统一结论。本文利用1m2（SL）、2m2（ML）和4m2（LL）3种不同面积的蒸渗仪在冬小麦（2012年11月21日播种,2013年6月20日收获）和水稻（2013年6月22日移栽,2013年10月28日收获）整个生长季进行连续蒸散量观测,筛选无有效降水日的数据进行对比分析。结果表明：（1）在冬小麦和水稻生长季内,SL（小）蒸渗仪所测蒸散量日内变化均表现出较大的变化幅度,ML（中）蒸渗仪所测蒸散量日内变化趋势均与LL（大）蒸渗仪所测一致,日内变化比较平稳;（2）ML蒸渗仪所测日蒸散量与LL所测结果的相关性最好（P<0.01）;（3）SL蒸渗仪所测水稻日平均蒸散量和蒸散总量与LL接近,所以可将SL蒸渗仪替代LL测定水稻日平均蒸散量和蒸散总量;ML所测冬小麦和水稻的日平均蒸散量及蒸散总量均比LL明显偏小,蒸散总量偏小主要由于拔节后较大的日蒸散量偏差导致。     

普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响

淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路.     

不同利用方式红壤磷素有效性的深度变化——以江西省余江县孙家小流域为例

在江西省鹰潭市余江县孙家红壤小流域的典型红壤区随机选取了具有代表性的林地(F)、花生旱地(PU)、新稻田(NP,<30 a)和老稻田(OP,> 200 a),在0~40 cm深度每隔5 cm采集分层土样,分析了土壤全磷(TP)、有效磷(Bray P)、磷素活化系数(PAC)及有机磷(Po)、无机磷(Pi)与各组分磷的深度变化,探讨了土壤pH与土壤有机质(SOM)对红壤磷素有效性的影响。研究结果表明:孙家小流域不同利用方式红壤TP含量大小依次为:老稻田>新稻田>林地>花生旱地;除林地外,花生旱地与稻田土壤TP、Bray P、Pi和Po含量随着土壤深度的增加呈显著降低趋势,且稻田土壤Po含量及其占全磷的比例显著高于林地和花生旱地。花生旱地与稻田0~20 cm土壤中极有效磷(EAP)、中等有效磷(MAP)及EAP、MAP中的无机磷与有机磷的比值均显著高于林地土壤。林地转为旱地和稻田,尤其是长期植稻可以促进土壤非有效磷(NAP)向利于作物吸收的EAP与MAP转化,因而提高土壤磷素有效性。相关分析表明,随着SOM累积量的增加,四种利用方式红壤中EAP、MAP含量均显著提高。     

响应面法优化碱性蛋白酶制备酪蛋白抗菌肽的研究

酪蛋白抗菌肽作为一种新型抗菌剂,分子量较小、热稳定性强、水溶性好、无免疫原性、对人无毒副作用等特点,可广泛应用于食品、药品、化妆品、饲料行业中。因此本研究利用碱性蛋白酶水解酪蛋白,以碱性蛋白酶浓度、酶解时间、酶解温度为影响因子,在单因素试验结果的基础上,应用Centure-Composite Design中心组合方法进行三因素三水平的实验设计,以酪蛋白水解液抑菌圈直径为响应值,运用响应面法对水解条件进行进一步的优化。结果表明：酶解温度、酶浓度、酶解时间对酪蛋白水解液抑菌圈直径影响显著;酪蛋白抗菌肽制备的最佳工艺为：水解温度为55.73℃,酶添加量为0.67%,酶解时间为66.07 min。回归方程预测酪蛋白水解液抑菌圈直径理论值可达到21.66 mm,3次验证实验的平均抑菌圈直径为21.67 mm,与理论最大值接近,可见该模型能较好地预测酪蛋白抗菌肽制备的最佳条件。     

几种新型农膜的小气候效应研究

研究了3种不同薄膜覆盖大棚内小气候因子的变化.研究结果表明,在不同测定日期中,覆盖不同塑料薄膜大棚的棚内外日平均气温和日平均地温变化相似,转光膜1的保温性能优于转光膜2和无滴膜;转光膜1的透光率高于转光膜2和无滴膜,无滴膜的透光率则略高于转光膜2.不论晴天还是阴天,转光膜,均表现出较好的保温与采光性能,而且使用这3种农膜后.大棚内温度和光强变化规律相似.     

南黄海族小黄鱼昼夜渔获率差异的统计学分析

利用2004年度东海区重点渔场底曳拖网渔业资源监测资料,从中选用小黄鱼网次渔获率作为指标值,应用LSD方法对南黄海族小黄鱼昼夜渔获率差异进行了统计学分析,以揭示小黄鱼昼夜的活动规律。结果表明,小黄鱼在不同的洄游阶段昼夜网次间渔获率无显著性差异,昼夜无垂直移动现象,常年处于底层,为典型的底层鱼类;在利用底曳拖网船进行渔业资源调查时,无需修正昼夜网次间小黄鱼的渔获率,用获取的调查数据即可估算资源量。     

Effects of CENP-W down-regulation on human glioma U87 cells

AIM: To study the effect of centromere protein W (CENP-W) down-regulation on human glioma U87 cells.METHODS: Small interfering RNA (siRNA) was used to inhibit the expression of CENP-W in the U87 cells. The interference effect of siRNA was evaluated by RT-qPCR and Western blot. The proliferation of the cells was analyzed by MTT assay, BrdU staining and colony formation experiment. Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of the cells. The cell migration ability was measured by a scratch test. The changes of the cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry.RESULTS: The results of MTT assay, colony formation experiment and BrdU staining showed that the cell proliferation and colony formation abilities in experimental group were significantly lower than those in control group and negative control group. The results of Transwell and scratch experiments showed that the migration and invasion abilities in experimental group were weaker than those in blank control group and negative control group. The results of flow cytometry analysis showed that the cell cycle distribution in experimental group was arrested in G₀/G₁ phase. The percentage of apoptotic cells in experimental group was higher than that in control group (P<0.05).CONCLUSION: Down-regulation of CENP-W expression inhibits the proliferation, migration and invasion of human glioma cells and promotes the apoptosis of the cells, suggesting that CENP-W may be a potential target of gene therapy for human glioma.