翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白表达、纯化及特性分析

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶。根据翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)Cu/Zn-SOD基因序列(Gen Bank登录号:KJ558392.1)设计表达引物,扩增获得截去信号肽后的一段460 bp的序列,序列经过鉴定后,构建了重组表达质粒p ET-30a+Sc Cu/Zn-SOD,并将该质粒转入到BL21(DE3)中,用IPTG诱导进行表达。经过优化表达条件得到可溶的Sc Cu/Zn-SOD重组蛋白(rScCu/Zn-SOD),纯化重组蛋白后测定rScCu/Zn-SOD的浓度和酶活性。结果发现在20℃和37℃条件下均能够诱导Sc Cu/ZnSOD的表达。37℃时重组蛋白主要以包涵体形式存在。降低诱导温度和补充Cu~(2+)/Zn~(2+)可提高rScCu/Zn-SOD的表达量。在20℃、0.5 mmol/L IPTG条件下,添加0.5 mmol/L CuSO_4和0.1 mmol/L ZnCl_2于培养基中,重组蛋白的表达量明显升高。纯化后的重组蛋白浓度为0.14 mg/m L,酶活力为108.5 U/mg。rScCu/Zn-SOD最适温度为37℃,最适pH为7.0,可耐受5%浓度的SDS蛋白质变性剂。     

鳜T细胞表面受体CD4分子的克隆与表达分析

克隆了鳜T细胞表面受体CD4分子的cDNA序列并对其在组织/器官的表达进行了分析。鳜CD4分子的cDNA序列全长为2 356 bp,编码469个氨基酸。该CD4分子由4个免疫球蛋白样结构域(V1C1V2C2)构成的胞外区、一个跨膜区和一个包含保守的CXC基序的胞内区组成。系统进化分析表明,鳜CD4分子与同属于鲈形目的鲈CD4分子聚为一支,与鲈的相似性最高(57%),与鲤的相似性较低(34%)。序列比对分析显示,CD4分子胞外区存在多个保守性位点,如:C1结构域中的WTC基序、V2和C2结构域中的N糖基化位点等。同鸟类和哺乳类不同的是,鳜CD4分子在V1结构域中缺少由半胱氨酸(Cys)残基对形成的二硫键,而在V2结构域中存在一个额外的二硫键,这可能会改变CD4分子的空间构象,进而影响到CD4与MHC Ⅱ的结合以及后续的抗原诱导的T细胞活化等。荧光定量PCR分析表明,CD4 mRNA在鳜的胸腺中表达量最高,在脾脏中表达量最低。脂多糖腹腔注射8 h后,CD4 mRNA在鳜的胸腺、脾脏和头肾中都呈显著的上调表达(P<0.05)。     

长江斑鳜的人工繁殖和苗种培育研究

摘要：长江班鳜(Siniperca scherzeri steindachner)的催产和受精卵的孵化受天气、温度、水温影响较大。在不同水温条件下效应时间、受精率明显不同。当水温在20±2℃时,效应时间大约为32小时,受精率大于80％,水温低于18时,效应时间明显延长,受精率也较低;在水温20-24℃时孵化时间大约125小时,孵化率均超过90﹪。班鳜幼苗出膜后大约经过30-56小时候开始开口。幼苗全长(L,mm)与日龄(D,d)的线性关系为L=3.244+0.926D。     

高温季节鳜及饵料鱼池塘水质调查研究

于高温多雨季节对广东省清远市鳜（Siniperca chuatsi）养殖基地的6个鳜及饵料鱼养殖池塘发病、用药情况及水质进行调查分析。结果表明,单独施用抑菌类药物,鳜出血病容易复发,而同时施用增强动物免疫力与减少应激行为药物及抑菌类药物,鳜出血病不易复发。鳜及饵料鱼塘发病期间,水中氨氮（NH4＋-N）质量浓度始终高于1.0 mg.L-1,亚硝酸盐氮（NO2--N）质量浓度高于0.18 mg.L-1,氮磷比（N/P）也有偏高的情况发生,而所调查的6个池塘硝酸盐氮（NO3--N）质量浓度均随养殖时间延长而逐渐下降。NH4＋-N与NO2--N质量浓度过高可能预示鳜的细菌性疾病即将发生。可按实际情况种植浮萍等植物吸收过量NH4＋-N;开增氧机保持水中高溶解氧（DO）以降低NO2--N质量浓度或投放减少动物应激行为的药物。N/P过高可适当释放磷肥以调节水质。     

鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢的研究

为了研究鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染CPB细胞,荧光观察发现Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;并且通过qRT-PCR和Western blotting检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1,GDH,IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。以上结果表明SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

鸭绿江斑鳜胚胎及胚后发育观察

于2005、2006年,连续观察了斑鳜Siniperca scherzeri受精卵的胚胎及胚后发育全过程。结果表明:斑鳜受精卵在22.2~25.2℃水温条件下,孵化所需时间约为144 h,胚胎发育到111 h,口裂已经形成,张合自如;破膜后54 h即可捕食活体鱼苗。斑鳜胚胎期即形成口裂、心脏、胸鳍、鳃盖等器官,在破膜前具备了较其它鱼类先天功能更完善、更复杂的生理结构,这一生理特点为其胚后体质强壮,开口即可捕食,消化活体鱼苗奠定了基础。     

细菌性败血症流行后翘嘴鳜血清中抗体特性分析

从细菌性败血症流行后的饲养池中捕捞翘嘴鳜,采集血清,以嗜水气单胞菌的福尔马林灭活菌体,菌体脂多糖,精制ＬＰＳ和胞外产物为反应抗原,对其抗体特性进行了分析。结果表明,受检翘嘴鳜血清中对Ｆ－ＬＰＳ和ＬＰＳ的平均凝集抗体效价分别为１：１９１和１：６９,对ＬＰＳ和Ｐ－ＬＰＳ在琼脂内扩散反应后分别出现４条以上和１条沉降线,而对ＥＣＰ则未出现沉降线;免疫电泳后,对ＬＰＳ和Ｐ－ＬＰＳ分别出现５条以上和２条沉降线     

翘嘴鳜、斑鳜及其杂交后代的胚胎和胚后发育比较

利用人工催产、人工授精的方法取得翘嘴鳜Siniperca chuatsi、斑鳜Siniperca schezeri及其正反交杂交后代的受精卵,在常温下对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交后代的胚胎和胚后发育进行了观察与比较。结果表明：4种卵子中,斑鳜及以斑鳜为母本杂交种的卵子大于翘嘴鳜及以翘嘴鳜为母本杂交种的卵子,前者直径为（1.86±0.07）mm,后者为（1.08±0.06）mm。在外部条件相同的情况下,4种胚胎发育时序基本以母本为基准,即以翘嘴鳜为母本的杂交种胚胎发育时序与翘嘴鳜的相同,以斑鳜为母本杂交种的则与斑鳜相同。在水温28.0～30.0℃下,以翘嘴鳜为母本的两种胚胎孵化需时约34 h,而在26.5～30.0℃下,以斑鳜为母本的两种胚胎孵化需时约91 h。以斑鳜为母本的初孵仔鱼比较大,全长为（4.60±0.07）mm,以翘嘴鳜为母本的初孵仔鱼全长为（4.00±0.05）mm。