鸡新城疫病毒HN基因片段的原核表达及其单抗制备

[目的]研究NDV-HN蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点。[方法]根据HN基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计1对引物,以该实验室保存的重组质粒为模板,进行PCR扩增,再将其所得片段定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒,并对该重组质粒进行鉴定;再将构建的重组质粒在大肠杆菌中表达;最后,鉴定了相应单克隆抗体。[结果]PCR结果表明,得到了与预期结果一致的长度为850 bp的片段;重组质粒鉴定结果表明,成功构建了包含目的基因片段的重组表达质粒pGEX-4T-HN23;重组质粒经原核表达获得大小为57 kD的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠试验表明,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代（可传20代以上）和分泌抗NDV-HN抗体的杂交瘤细胞株。[结论]获得的鸡新城疫病毒HN单克隆抗体,为进一步研究HN在致病过程的作用及特异性诊断提供了重要试验材料。     

鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

HIV VRC01单链抗体的构建、原核表达及纯化

【目的】合成、克隆HIV单克降抗体VRC01的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。【方法】根据GenBank上公布的VRC01抗体可变区的氨基酸序列合成引物,运用基因从头合成和重叠延伸PCR方法,克隆抗体VRC01的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因;用15肽Linker(Gly4Ser)3将VH和VL基因相连,得到单链抗体基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,并分别将两者克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;将重组蛋白进行变性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行初步纯化。【结果】得到了VRC01的2种单链抗体的基因scFv-VH-Linker-VL和scFv-VL-Linker-VH,其大小分别为770和768bp。SDS-PAGE电泳结果显示,scFv-VH-Linker-VL在大肠杆菌中不表达或表达量极低;而scFv-VL-Linker-VH表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,且主要以包涵体形式存在。Western blot检测结果证实,scFv-VL-Linker-VH可与His-Tag融合表达,并通过亲和层析法成功纯化获得了该单链抗体。【结论】成功构建、表达并纯化出了VRC01单链抗体,为进一步研究VRC01单链抗体的生物学特性奠定了基础。     

外源重组蛋白制备鹅免疫球蛋白轻链特异性多克隆抗体

采用RT-PCR方法扩增鹅免疫球蛋白轻链恒定区编码序列(GoIgCL),构建原核表达载体pET30a-IgCL,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达鹅免疫球蛋白轻链恒定区重组蛋白rGoCL,以纯化后rGoCL作为免疫原制备兔抗GoIgL多克隆抗体,对多抗进行鉴定分析.结果表明,rGoCL在大肠杆菌中获得可溶性表达,可代替天然分离的轻链作为免疫原制备轻链特异性抗体,多抗效价为1 204800.研究为鹅免疫球蛋白的蛋白结构、功能分析以及鹅免疫诊断试剂研发奠定基础.     

南芥菜花叶病毒衣壳蛋白的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

为开发百合中南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)的血清学检测技术及研究ArMV的致病机理,原核表达ArMV衣壳蛋白(coat protein, CP),纯化并制备其多克隆抗体。以侵染东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)的ArMV基因组为模板,克隆ArMV CP基因全长,构建ArMV CP基因原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)原核表达ArMV CP蛋白,并以纯化ArMV CP蛋白为抗原制备兔抗多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明:克隆获得百合ArMV CP序列(GenBank登录号:MT323117)全长,其长度为1 515 bp,与已知的ArMV CP基因核苷酸序列相似性最高达到93.6%,氨基酸序列相似性最高达到98.2%;SDS-PAGE表明CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为56 ku; Western blot结果显示抗体能够特异性结合ArMV CP蛋白,具有良好的特异性。     

感染鸡贫血病毒雏鸡接种新城疫疫苗后免疫保护效应及其机理研究

 雏鸡 1日龄人工感染鸡贫血病毒 (CAV) ,于 8日龄接种 L asota疫苗 ,免疫后 2 8d进行新城疫强毒 (v NDV)攻击 ,以同龄未感染 CAV和用 L asota疫苗免疫并经 v NDV攻毒雏鸡为对照 ,检测其免疫保护效应 ,胸腺和脾脏 T细胞数量及 T细胞增殖反应 ,法氏囊和脾脏 Ig G+、Ig M+、Ig A+抗体生成细胞数量 ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A含量 ,血凝抑制抗体 (HI)滴度等。结果表明 ,CAV人工感染并用新城疫 (ND)疫苗免疫雏鸡经 v NDV攻击后的免疫保护率为 6 0 % ,对照组雏鸡 v NDV攻击后免疫保护率为 10 0 % ,胸腺和脾脏 T细胞数量和 T细胞增殖反应、法氏囊和脾脏Ig G+ 、Ig M+ 、Ig A+ 抗体生成细胞数量、血清 Ig G、Ig M、Ig A含量及 HI抗体滴度 ,均较对照组雏鸡显著降低。说明感染鸡贫血病毒雏鸡接种新城疫疫苗后的免疫保护效应及免疫功能明显降低。     

鸡传染性法氏囊病母源抗体对弱毒疫苗免疫效果的影响

雏鸡传染性法氏囊病 (IBD)母源抗体高低不一是造成免疫失败的主要原因 ,利用琼脂扩散试验对不同日龄的 2 76群鸡母源抗体以及免疫前后抗体的检测 ,了解鸡传染性法氏囊病母源抗体对IBD弱毒疫苗免疫效果的影响 ,从而找出最佳免疫时机     

单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究

从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种发生于禽类的病毒性传染病。笔者以杂交瘤技术研制抗AIV共同抗原的特异单克隆抗体,旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法快速检测AIV,以便为A型AIV的快速诊断技术的研究提供理论依据。