黄河裸裂尻生长激素(GH)基因的PCR扩增和克隆

为了克隆黄河裸裂尻生长激素(GH)基因并获得表达产物,试验采用异硫氰酸胍法提取黄河裸裂尻脑组织总RNA,以分离的RNA为模板,采用RT-PCR扩增获得GH基因cDNA,将cDNA插入质粒pQE30中,并在大肠杆菌RB791中表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况。结果表明:扩增后黄河裸裂尻GH基因长度为508 bp,黄河裸裂尻GH基因与青海湖裸鲤的同源性很高,电泳显示出1条新的分子质量约为14.4 ku的特异性条带。     

猪CD4分子的全长cDNA克隆与序列分析

CD4分子为动物辅助性T细胞（TH）和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子，参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程。本研究应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD4全长cDNA序列，并进行了序列特性分析。序列分析结果表明，在猪胸腺细胞和外周血淋巴细胞中存在2种方式剪接的CD4 mRNA转录本，其中一种mRNA转录本缺失编码40个氨基酸残基的120nt序列，提示该转录本可能编码猪分泌型CD4分子；猪CD4全长cDNA序列为2715nt。其中5′非编码区159nt，3′非编码区1183nt，1374nt的开放阅读框编码457个氨基酸的猪CD4前体蛋白（含4个糖基化住点）；猪CD4分子的7个Cys残基（Cys^43、Cys^122、Cys^327、Cys^418、Cys^421、Cys^444和Cys^446）和2个Ser残基（Ser^432和Ser^439）在动物种间保守；在猪CD4分子胞浆区．存在高度保守的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk。识别位点KKTCQC和内化相关双亮氨酸基序。推导氨基酸序列分析结果显示，猪与人、免、猫、狗和鼠CD4蛋白的氨基酸同源性分别为56．0％，54．5％。56．9％，56．5％和44．9％。     

家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆与表达特征分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)在糖酵解最后一步起着不可逆的作用,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP和丙酮酸。通过在NCBI和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)数据库中对丙酮酸激酶基因的比对分析,选择家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的一个基因(NbPK-2,GenBank登录号EOB11679.1)进行克隆。生物信息学分析显示,该基因序列长度为1 359 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸,预测蛋白质等电点为7.13,相对分子质量为51.7 kD,没有信号肽;NbPK-2蛋白的二级结构预测显示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%无规则卷曲。通过qRT-PCR检测感染微孢子虫后家蚕不同发育时期的NbPK-2表达水平,发现该基因在感染后24 h内处于相对较高的表达水平,而此后表达水平开始降低,至144 h达到最低值,在168 h又有所升高。研究结果可促进对家蚕微孢子虫糖酵解途径的研究,为家蚕微粒子病的防控奠定理论基础。     

Cloning,Expression of Clostridium perfringens α-toxin Gene and Preparation of its Antisera

One pair of primers had been designed and synthesized based on the α-toxin gene of Clostridium perfringens.The complete α-toxin gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then was cloned into pGEM-T Easy vector to construct pGEM-T-α.Digested with EcoRⅠ and Hind Ⅲ, a fragment of 1125 bp was cloned into the expression plasmid vector pET-28a(+).The recombinant plasmid was transformed into the BL21(DE3)plys and induced by 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃.The expression product was found to be 46.1 ku as expected one identified by SDS-PAGE, and confirmed by Western blotting with Clostridium perfringens type A antisera, indicating similar reactivity with native α-toxin.Recombinant α-toxin protein was simultaneously found in culture supernatant, postsonic supertanant and inclusion bodies, most protein was expressed in inclusion bodies, which indicated recombinant α-toxin protein was expressed in the extracellular, periplasm and cytoplasm.Recombinant α-toxin protein in postsonic supertanant could not make mice die, indicating its non-toxicity.Toxin-antitoxin neutralization test showed that antisera of recombinant α-toxin protein were specific to α-toxin.Upon immunization of rabbit with the recombinant α-toxin protein, antisera with high antibody titer neutralizing 100 MLD toxin per 1 mL were prepared.     

猪细胞因子cDNA表达文库的构建及其基因的克隆鉴定

为克隆和研究猪细胞因子及相关基因,应用建库试剂盒成功构建了猪细胞因子cDNA表达文库。采取健康猪外周血及淋巴结,分离单个核细胞,经LPS PHA联合刺激不同时间后,提取总RNA。将各组样品混合,分离纯化mRNA。反转录合成cDNA第一链和第二链,与EcoRI和HindⅢ接头连接。酶切和过柱分级分离后,与λScreen载体连接,经体外包装转染E.coliER1647宿主菌,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆猪IL-2和IL-4的cDNA并进行测序。结果表明,成功构建了猪细胞因子cDNA文库,文库原始库容量为8×105,插入片段在300~2 000 bp,扩增得到特定的IL-2和IL-4基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

6株猪O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了2对用于扩增VP1基因的引物。从组织中提取总RNA，首先用P1、P2引物对6株猪。型口蹄疫病毒进行RT—PCR扩增，获得1000bp的片段；再用P3、P4引物进行巢式PCR扩增，结果获得850bp的片段。将850bp的片段克隆到pMD18—-T载体中，通过PCR鉴定，将阳性重组质粒进行测序并分析。结果发现6株FMDV的核苷酸同源性为80．2％～99．4％，其推导的氨基酸序列同源性为86．9％～99．5％；构建遗传发生树，发现6株FMDV属于两个不同的基因型，其中的Shunde00、Sihui01、Shenzhen99、Fushan01株属一个基因型（与Hongkong93、广东86分离株属同一基因型）；Guangzhou99、Shenzhen00株属另一个基因型（与UKG-12—2001株、JPN2000株属同一基因型）。通过对口蹄疫病毒VP1基因的测序与分析，了解其变异情况，为科学地防控FMD提供分子水平的依据。     

水貂12S rRNA基因的克隆

为探讨水貂的系统发育关系,对金州水貂的12S rRNA基因进行了克隆测序,序列长度为450 bp。结果表明,金洲水貂的12S rRNA基因与伶釉的同源性为92.48%,与林釉的同源性为91.83%,与北美水貂的同源性为90.99%,与獾的同源性为90.99%。     

鸭源呼肠孤病毒DRV-GZ株S2基因的序列分析及其表达

采用RT-PCR方法从鸭源呼肠孤病毒DRV—GZ株中扩增出了S2基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a（＋）中,测序验证后转化入表达宿主菌Rosetta^TM2（DE3）plysS,进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达出相对分子质量约为50000的重组融合蛋白,在浓度为0．6mmol／L的IPTG诱导4h的情况下表达效果最好。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能与抗呼肠孤病毒DRV—GZ株阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证实表达的蛋白具有较好的反应原性。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。