重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

一株产碱性蛋白酶的酵母菌发酵条件优化

对一株产碱性蛋白酶假丝酵母菌(Candidasp.N9211)的发酵条件进行了优化,研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成。结果表明:最佳培养基组成为酵母膏20g/L,蛋白胨15g/L,干酪素20g/L,硫酸亚铁0.01g/L。优化后蛋白酶活性提高了27倍(由1.55U/mL提高到41.85U/mL)。摇瓶培养的最佳条件为:初始pH值10.0,接种量1%,发酵温度35℃,最佳培养时间为15h。     

BmNPV半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列研究

对家蚕核型多角体病毒苏州株（BmNPVsu）光胱氨酸蛋白酶基因（CP）的序列分析表明,该基因读码框为972个核苷酸,编码323个氨基酸。同源性分析表明,BmNPVsu的CP与首蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）、美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）、云杉卷叶蛾核型多角体病毒（CfNPV）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（OpNPV）、舞毒蛾核型多角体病毒（Ld-NPV）在DNA水平上的同源性分别为96.5％、76.2％、74.9％、72.7％、62.9％;在氨基酸水平上的同源性分别为96.9％、77.1％、79.3％、77.1％、65.6％。BmNPV CP的氨基酸序列与不同来源的木瓜蛋白酶超家族的CP也具有较高的同源性,特别与 Trpanosoma brucei的CP具有较高的一致性,达32％。在组织蛋白酶B、H、L、S以及木瓜蛋白酶的36个保守氨基酸残基中有31种出现在BmNPVsu的CP中,BmNPVsu CP同其它杆状病毒CP一样,可看作木瓜蛋白酶超家族成员。     

产碱性蛋白酶菌株ZK202的鉴定及其诱变

[目的]为产碱性蛋白酶菌株在生产中的应用提供依据。[方法]从河南省兰考县盐碱地土壤中分离1株产碱性蛋白酶的菌株ZK202,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析对其进行鉴定。经紫外照射和DES处理后,测定诱变菌株的酶活力。[结果]菌株ZK202的形态符合芽孢杆菌属的特征,其16SrDNA序列与短小芽孢杆菌的同源性在99%以上。该菌株为短小芽孢杆菌一个新亚种,命名为Bacillus pumilus ZK202,属中等嗜盐菌。ZK202在氯化钠浓度0～12.5%条件下均能生长,以浓度5.0%时最佳。ZK202在碱性环境中生长良好,当培养基pH值在11.0以上时仍能生长,也属嗜碱性菌。经复合诱变后,菌株Zkud202-4发酵液的酶活力达321U/ml,比出发菌株高3.9倍。[结论]Zkud202-4具有稳定的产酶性能,可作为产碱性蛋白酶的突变菌株。     

糙米发芽过程中蛋白酶活力及含氮物质的变化

以糙米为原料,研究其发芽过程中蛋白酶活力及蛋白质含量、组成、水解度和肽含量等降解产物的变化。结果表明:糙米经48h发芽,与未发芽前相比,蛋白酶活力增加3.39倍,蛋白质水解度提高5.37倍,肽总量升高38.68%,水解度与肽含量间相关系数达0.9606;清蛋白和球蛋白含量下降74.76%,谷蛋白和醇溶蛋白含量增加95.68%,游离氨基酸含量升高2.17倍,非蛋白氮含量增加。糙米发芽72h时,蛋白酶活力增幅减小,蛋白质水解度及肽含量继续升高,而清蛋白增多,谷蛋白减少。SDS-PAGE测定结果显示,糙米发芽过程中,大分子量的蛋白质组分降解,小分子量的多肽类成分增加,游离氨基酸含量显著升高;发芽48h前蛋白质的转化与降解趋势平缓,之后其变化极显著。因此,糙米发芽48h是其含氮物质变化的重要转折点。     

苏云金芽孢杆菌8010蛋白酶基因保守区克隆及序列分析

通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段(可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因).     

碱性蛋白酶酶解丰年虫卵蛋白工艺条件优化

以丰年虫卵为原料,利用碱性蛋白酶酶解制备营养价值更高的多肽,并对其水解参数进行优化.以水解度(DH)为指标,通过单因素试验研究酶解时间、酶解温度、pH、底物质量分数及加酶量等因素对碱性蛋白酶酶解丰年虫卵蛋白质过程的影响.在此基础上利用3因素(pH、酶解温度和加酶量)中心组合试验设计,得出最优酶解时间为150 min,底...     

苜蓿草粉对禾花鲤蛋白酶和淀粉酶活性影响的研究

选取来源一致、规格整齐的2龄禾花鲤1 200尾,采用单因子完全随机设计,分为5个处理,每处理3个重复,每重复80尾鱼,分置于15个试验池中。各处理苜蓿Medicago sativa草粉的添加量分别为0（对照组）、40（试验Ⅰ组）、80（试验Ⅱ组）、120（试验Ⅲ组）和160 g/kg（试验Ⅳ组）,正试期50 d,观测苜蓿草粉对禾花鲤前、中、后肠及肝胰脏蛋白酶和淀粉酶活性的影响。结果表明：1）添加苜蓿草粉对前肠蛋白酶活性有显著影响 (P<0.05),其中试验II组显著高于对照组和试验Ⅳ组,但和试验Ⅰ、Ⅲ组差异不显著 (P>0.05)。添加苜蓿草粉对中、后肠及肝胰脏蛋白酶活性均无显著影响 (P>0.05),但它们有相同的变化趋势,即试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组鱼的蛋白酶活性均高于对照组。2）鲤鱼的前肠、中肠、后肠蛋白酶活性依次减弱,而肝胰脏的蛋白酶活性远低于肠道。3）添加苜蓿草粉后前肠及中肠淀粉酶活性比较,试验II组显著高于对照组 (P<0.05),其余各组与对照组差异不显著 (P>0.05),后肠淀粉酶活性与对照组无显著差异 (P>0.05)。添加苜蓿草粉能提高鲤鱼肝胰脏淀粉酶活性,其中试验Ⅱ组显著高于对照组 (P<0.05),其余试验组与对照组无显著差异 (P>0.05)。4）禾花鲤前、中、后肠及肝胰脏4部分淀粉酶的活性有较大的不同,肝胰脏>后肠>中肠>前肠。     

重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶产生条件及酶活影响因子

重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans是核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的重要生防菌。为了探讨盾壳霉胞外蛋白酶在寄生核盘菌过程中的作用,采用明胶平板法对盾壳霉寄生核盘菌菌核产生的蛋白酶活性进行了检测,并进一步采用福林酚法定量测定蛋白酶活性,研究盾壳霉产生胞外蛋白酶的培养条件及影响蛋白酶活性的因子。试验结果表明,在被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中检测到蛋白酶活性,表明蛋白酶可能参与盾壳霉重寄生作用。发现核盘菌菌核浸出液培养基适合盾壳霉产生胞外蛋白酶,摇培(20℃、200r/min)5d时蛋白酶活性最高,达到0.22U/mL。盾壳霉胞外蛋白酶酶促反应的最适温度为60℃,最适pH7.0。当温度不高于40℃时,蛋白酶酶活较稳定。5mmol/L的金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Li⁺和K⁺等对蛋白酶酶活没有显著影响(P>0.05),而Fe²⁺(5mmol/L)显著(P<0.05)提高了蛋白酶活性。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟(PMSF)敏感,说明盾壳霉产生的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶。这些结果为盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化和功能研究奠定了基础。     

大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼、幼鱼蛋白酶和淀粉酶活力的影响

【目的】研究大豆抗原蛋白大豆球蛋白(Glycinin)对鲤稚鱼、幼鱼蛋白酶和淀粉酶活力的影响。【方法】以鱼粉为动物蛋白源,混合油脂(m(玉米油)∶m(鱼油)=1∶1)为脂肪源,糊精、面粉为糖源,分别配制大豆抗原蛋白Glycinin添加量为0(CK),30,60,90,120g/kg的5种等氮(稚鱼、幼鱼饲料粗蛋白分别为400和360g/kg)等能(稚鱼、幼鱼饲料总能分别是16.9和15.2MJ/kg)的试验饲料。分别以初始体质量为(10.12±0.08)g/尾的鲤稚鱼和(116.89±0.13)g/尾的鲤幼鱼为试验对象,在控温单循环养殖系统中,进行为期8周的饲养试验,每组饲料设3个重复,探讨大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼、幼鱼蛋白酶和淀粉酶活力的影响。【结果】在鲤稚鱼和幼鱼的配合饲料中,添加不同比例大豆抗原蛋白Glycinin,导致其肠道和肝胰脏蛋白酶活力不同程度下降。其中,鲤稚鱼大豆抗原蛋白Glycinin添加量为30,60,90和120g/kg组的前肠和后肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05);而30和60g/kg组中肠和肝胰脏蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05),90和120g/kg组中肠和肝胰脏蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)。在鲤幼鱼配合饲料中,当大豆抗原蛋白Glycinin的添加量为30和60g/kg时,前肠和后肠蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05),90和120g/kg组前肠和后肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05);而30g/kg组中肠蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05),60,90和120g/kg组显著低于对照组(P<0.05);肝胰脏蛋白酶活力各组之间差异不显著(P>0.05)。在本试验条件下,大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼和幼鱼肠道及肝胰脏淀粉酶活力影响不显著(P>0.05)。【结论】在本试验条件下,大豆抗原蛋白Glycinin添加量为30g/kg时,鲤稚鱼前肠和后肠蛋白酶活力显著下降,添加量为60g/kg时,鲤幼鱼中肠蛋白酶活力显著下降,但大豆抗原蛋白Glycinin对鲤稚鱼和幼鱼淀粉酶活力影响不显著。