Occurrence and characterization of gastric Helicobacter spp. in naturally infected dogs

Helicobacter-like organisms are frequently observed in the stomach of dogs but the relationship between these microorganisms and gastric pathology has not been clearly established. Different species of helicobacters are known to be present in the canine stomach but their specific prevalence in naturally infected dogs is unknown. The aims of this study were to isolate and characterize helicobacters in canine gastric biopsies, to compare the commonly used tests for the identification of Helicobacter spp. and to determine the occurrence of these species in dogs. Twenty-three out of 25 dogs (92%) were positive for Helicobacter-like organisms in cytological screening. Culture was successful from biopsies of 5/25 dogs. The isolates were analyzed by electron microscopy, biochemical and physiological tests, whole protein analysis and 16S rDNA sequencing. Helicobacter felis was identified in four samples and Helicobacter bizzozeronii in one sample. Only the whole protein analysis in combination with electron microscopy was able to clearly discriminate the two species. Compared to the high prevalence of Helicobacter-like organisms, the occurrence of H. felis and H. bizzozeronii, was low (17 and 4%, respectively). No Flexispira rappini-like organisms or H. salomonis were detected. Electron microscopy revealed that H. bizzozeronii-like microorganisms were present in three additional biopsies where we were unable to culture any Helicobacter-like organisms. These observations indicate that in the stomach of dogs not all helicobacters are culturable. The unculturable bacteria appeared to be the prevalent ones and may represent different spiral organisms. The presence of distinct helicobacters with different characteristics can reflect different roles in the pathogenesis of canine gastric disease.     

玉米大斑病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和表达分析

利用RT-PCR技术克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的GAPDH基因StGAPDH。该基因c DNA全长1 014 bp,编码337个氨基酸;蛋白质分子量36 505.44,理论pI值6.72,属弱酸、亲水、稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为43.5%、30.4%和21.7%;氨基酸序列高度保守,在亲缘关系上与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)最近。荧光定量PCR分析表明,在病菌接种抗病玉米自交系3 d时,StGAPDH基因表达量显著高于接种5～10 d(P<0.05);接种感病玉米自交系时,接种10 d的StGAPDH基因表达量显著高于接种3～7 d(P<0.05)。     

芒果细菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆与序列分析

根据黄单孢菌属LuxR基因的同源性设计简并引物XF/XR,采用同源克隆法从芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)中获得了约1.4 kb的DNA片段。经测序和序列同源性分析表明,该基因片段长1 422 bp含有一个完整的LuxR同源基因,并命名为XcmR。生物信息学分析表明,XcmR基因完整ORF(开放阅读框)全长765 bp,编码254个氨基酸,分子质量和等电点分别约为28.2 ku和8.9,与GenBank中公布的Xanthomonas属LuxR或AhyR/AsaR氨基酸序列具有86%~99%相似性。系统聚类结果表明,XcmR与来源于柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、番茄疮痂病菌(X.c.pv.vesicatoria)、水稻白叶枯菌(X.oryzae pv.oryzae)和甘蓝黑腐病菌(X.c.pv.campestris)的LuxR蛋白聚成一支。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,XcmR是LuxR蛋白家族的一员,具有LuxR蛋白相似结构。     

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。     

普通小麦TaSEC14p-5基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白,含有一个典型的SEC14保守结构域.S0ec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中,并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动,但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道.为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能,本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因,命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号:KU639968).氨基酸序列分析表明,该基因ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,相对分子质量为37.1 kD,理论等电点为7.70.在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域.进化和聚类分析表明,小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为96.45％和88.38％.采用qRT-PCR技术,对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析.发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达,且在茎中表达量较高,雄蕊次之,根最低;该基因受高盐的强烈诱导,同时也受到脱落酸(abscisic acid,ABA) (200μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4℃)不同程度的胁迫诱导.TaSEC14p-5在NaC1、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下,总体趋势为先上升后下降.结果推测,TaSEC14p-5基因可能参与了NaC1、ABA、PEG6000和4℃等不同程度的非生物胁迫处理,为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据.     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。     

黑皮冬瓜LINE逆转座子RT序列的克隆与特征分析

根据LINE逆转座子逆转录酶保守序列设计简并引物,PCR扩增黑皮冬瓜"B98K"基因组DNA,获得580 bp左右目的条带。将PCR产物回收、克隆并测序,获得23条逆转酶序列,利用生物信息学软件分析其长度变异、碱基变化、相似性及系统进化关系。结果表明:这些序列长度在557~593 bp区间变异,同源比对核苷酸序列相似性为39.0%~99.3%,存在高度异质性,主要表现为缺失突变、移码突变与终止密码子突变,核苷酸序列聚类分析分为4个家族,家族1与家族2分别包含15和5个成员,占总序列数的65.22%和21.74%。对推导的氨基酸序列分析发现,第12位氨基酸残基处存在一保守的苯丙氨酸(Phe),多处位置存在半保守氨基酸残基;氨基酸序列相似性在20.0%~99.5%之间;其中8条序列可能具有转录活性,8条与15条序列分别发生移码与终止密码子突变。与已知物种构建系统发育进化树,发现冬瓜LINE逆转座子RT序列较保守,且与拟南芥、李、油菜等有较近的亲缘关系。研究结果为后续利用分子标记研究冬瓜种质遗传变异及基因组进化奠定基础。     

大鲵虹彩病毒流行株的分离及其主衣壳蛋白编码基因序列比较分析

大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)是近年中国大陆新发现的引起人工养殖大鲵(Andrias davidianus)大规模死亡的病毒病原。为了揭示大鲵虹彩病毒流行株的基因型差异, 本研究对2010–2012年采集自全国不同大鲵养殖区域的患虹彩病毒病的大鲵样本进行了分子检测、病毒分离培养以及病毒主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因测序与比对分析。结果显示, 采自陕西、湖北、湖南、浙江、江西、福建等省的10个样本检测为阳性, 通过细胞培养获得10株病毒流行株。对该10株流行株MCP基因的测序与比对分析发现, 核苷酸序列相似性达到99.7%~100%, 其推测的氨基酸序列无明显差异, 证实中国大鲵虹彩病毒流行株属同一基因型。系统进化树分析结果表明, 所选大鲵虹彩病毒与蛙病毒分别聚为一枝, 但其亲缘关系较近。本研究结果旨为大鲵虹彩病毒病的疫苗研制及其免疫防控技术研究奠定基础。

     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。