猪繁殖与呼吸综合症流行株ORF_5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症发病原因,流行趋势,为预防和控制猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）提供理论依据。[方法]根据GenBank上的PRRSV的ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术扩增了7株流行株中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的系统进化树。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～98.8%,89.9%～95.2%,85.6%～98.7%;与LV的同源性为54.7%～56.9%。氨基酸序列分析表明,这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～96.8%,88.1%～94.5%,86.1%～96.5%;与LV的同源性为54.7%～56.2%。[结论]流行株在ORF5基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF5基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

偏肿革裥菌系统发育与Lg-mnp2和Lg-mnp3基因克隆及结构特征

白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。     

牛Musclin基因片段克隆与序列分析

[目的]对牛Musclin基因片段进行克隆与序列分析。[方法]通过电子克隆技术克隆牛Musclin基因,并通过软件分析牛Musclin基因与小鼠、大鼠、人、猪和鸡的同源性。[结果]通过电子克隆技术成功克隆了牛Musclin基因;分析结果表明,牛Musclin基因与小鼠、大鼠、人、猪和鸡同源性分别为81．0％、80．8％、90．0％、89．1％和62．4％,预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域,并将克隆的牛Musclin基因片段注册GenBank（EF646361）。[结论]该试验为进一步研究Musclin在牛骨骼肌中的生物学功能提供了基础资料。     

三株广西狂犬病病毒NS基因和M基因的克隆与序列分析

本研究设计了一对特异性引物NSM1/NSM2,对三株广西狂犬病病毒NS和M基因同时进行了RT_PCR扩增、克隆和测序。同源性分析表明,三株广西野毒NS基因核苷酸同源性为87.2%~98.4%,M基因核苷酸同源性为90.1%~99.7%;与固定毒和狂犬病相关病毒比较,NS基因分别为79.9%~82.8%和69.7%~71.0%;M基因的分别为82.8%~87.8%和75.0%~77.8%。三株野毒NS基因氨基酸同源性为93.3%~98.7%,M基因氨基酸同源性分别为97.5%~100%。表明广西各地毒株之间亲缘关系不同,但最为相近;与狂犬病固定毒株亲缘关系较远;与狂犬病相关病毒亲缘关系最远。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

家蝇幼虫双翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆与原核表达

对鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的家蝇双翅肽I(Musca domesticaDiptericin I,MdDptI)基因进行克隆、表达,并对表达产物的抑菌活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),对MdDptI基因进行扩增,并对扩增产物进行测序和生物信息学分析,进一步去掉信号肽并构建重组表达质粒pET-28a-MdDptI,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和纯化获得目的蛋白,并验证目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全长为419 bp,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),编码99个氨基酸,其cDNA序列与GenBank中登录号为FJ794602.1的家蝇双翅肽基因同源性为95%。构建了家蝇MdDptI基因的成熟肽原核表达质粒pET-28a-MdDpt-I,并获得成功表达,表达产物约为12 ku,与预期结果一致。纯化后的目的蛋白表现出一定的抑菌活性。本试验获得了MdDptI基因的全长序列,构建了原核表达载体,并成功获得表达纯化。     

对虾病原菌2—5B菌株16SrRNA基因片段的克隆和序列测定

用引物ＰＬ１－ＰＬ２ＰＣＲ扩增对虾病原菌－坎普氏弧菌２－５Ｂ菌株１６ＳｒＲＮＡ基因－１２２３ｂｐ的片段，采用ｐＵＣ１９质粒构建ｄＴ载体法完成该片段的克隆。部分序列测定及分析结果表明，该菌株与ＧｅｎＢａｎｋ中坎普氏弧菌标准株序列之间同源性为９６．９４％。     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

海南木豆丛枝植原体质粒全序列测定及分析

提取木豆叶片基因组总DNA,通过克隆,测序木豆丛枝植原体海南株系质粒(pPPWB-Hn)的完整DNA序列,并使用生物信息学软件对该质粒全长序列进行分析。分析结果显示:pPPWB-Hn质粒全长4 218 bp,含有4个开放阅读框,分别编码Rep、dnaG、threonine synthase和未知蛋白。其中,Rep是2次跨膜蛋白,dnaG是单次跨膜蛋白,Rep和dnaG均与质粒自主复制有关。Rep和未知蛋白可能分布在细胞质中,dnaG可能定位到细胞膜上或膜外,Threonine synthase可能定位到线粒体膜上或线粒体内腔。系统进化树显示:pPPWB-Hn与植原体16SrⅡ组的pPNWB(AY270152),pTBBperi(DQ119297)及pTBBcap(DQ119296)处在同一进化分支。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。