稻瘟病菌NAD(H)激酶Mopos5互作蛋白的筛选

为了探索Mopos5可能参与的信号网络,了解其作用的分子机制,利用酵母双杂交系统筛选了稻瘟病菌cDNA文库,获得了6个与Mopos5互作的蛋白;结合生物信息学预测分析和相关文献报道,发现这些候选互作蛋白很可能参与调控了细胞骨架建成、细胞运动、细胞分裂、细胞老化与死亡、线粒体功能维持、胁迫防御反应、物质与能量代谢和信号传导等多种多样的生物学进程。进一步分析这些互作蛋白的生物学功能及与Mopos5的互作机制,对于了解Mopos5可能参与的信号网络及其调控稻瘟病菌在寄主组织内定殖和扩展的分子机制具有重要的意义。     

利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

【目的】筛选介体灰飞虱（Laodelphax striatellus,SBPH）中与水稻条纹病毒（RSV）病害特异蛋白（disease-specific protein,SP）可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N相连接以构建高质量灰飞虱cDNA文库,通过电转化的方法对灰飞虱cDNA文库进行扩增并进行cDNA文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白,通过Western Blot方法检测诱饵载体上的目的基因SP是否表达,并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后,用诱饵载体与文库质粒pPR3-N共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA文库筛选条件并明确3-AT浓度。对灰飞虱cDNA文库进行筛选并对筛选结果进行分析,对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA,通过SMART技术合成的ds cDNA大小介于0.1-4.5 kb。构建的灰飞虱cDNA文库的库容量超过1.2×106 cfu,文库滴度为1.12×108 cfu/mL,扩增文库插入片段平均长度大于1.5 kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP成功构建;Western Blot结果表明诱饵载体pDHB1-SP能够在NMY51中正常表达;功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP适合该系统。在3-AT浓度为20 mmol?L-1的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA文库中筛选得到534个克隆,经测序、Blast比对最终得到76个可能与RSV的SP发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析,挑选出20个蛋白质进行共转和β-galactosidase检测,结果表明这20个蛋白质均与RSV SP互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA文库及酵母双杂交技术,筛选出了与RSV SP互作的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制,及RSV的SP在传毒过程中的功能打下了基础。     

茄子花青素合成中SmTTG1、SmGL3和SmTT8的表达及其蛋白质间的相互作用

采用同源克隆方法从茄子（Solanum melongena L.）中分离得到3个基因,分别命名为SmTTG1、SmGL3和SmTT8。序列分析表明,SmTTG1的cDNA全长1 220 bp,开放阅读框为1 029 bp,编码342个氨基酸,与马铃薯（S. tuberosum L.）TTG1基因序列同源性达到94%,成熟蛋白等电点为4.90,具有典型的WD结构域;SmGL3的cDNA全长2 329 bp,开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,与马铃薯GL3基因序列相似性达到94%,蛋白等电点为5.61,有典型的HLH结构域;SmTT8的cDNA全长2 242 bp,开放阅读框为1 896 bp,编码631个氨基酸,与马铃薯TT8基因序列同源性为85%,蛋白等电点为5.18,有典型的HLH结构域。荧光定量检测结果表明,SmTTG1、SmGL3和SmTT8在茄子根、茎、叶、花、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性。酵母双杂交结果表明,SmTTG1与SmTT8、SmGL3之间有相互作用,并且SmTTG1、SmGL3和SmTT8都与SmMYB之间发生作用。推测SmTTG1为WD40转录因子,SmGL3和SmTT8为bHLH转录因子,它们都参与调控茄子花青素的合成。     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

活性干酵母和纤维素酶对草原红牛瘤胃挥发性脂肪酸浓度及甲烷排放的影响

利用大型动物开放式呼吸测热装置等设备,研究活性干酵母和纤维素酶对草原红牛瘤胃挥发性脂肪酸浓度及甲烷排放的影响。试验选用8月龄、体况相近的草原红牛公牛4头,采用4×4拉丁方试验设计分为4组:Ⅰ组为对照组,饲喂基础日粮,Ⅱ组在基础日粮中添加200 mg/kg活性干酵母,Ⅲ组在基础日粮中添加190 mg/kg纤维素酶,Ⅳ组在基础日粮中添加200 mg/kg活性干酵母和190 mg/kg纤维素酶,试验分4期,每期37 d。结果表明,日粮中添加活性干酵母后,对瘤胃内丙酸浓度和总挥发性脂肪酸浓度影响显著(P<0.05),Ⅱ、Ⅳ组总挥发性脂肪酸浓度和丙酸浓度显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05);活性干酵母显著抑制了草原红牛甲烷的产生(P<0.05),Ⅱ组甲烷排放量比Ⅰ组降低9.84%;纤维素酶对草原红牛瘤胃挥发性脂肪酸及甲烷排放的影响均不显著(P>0.05)。因此,日粮中添加活性干酵母能促进草原红牛瘤胃发酵,增加丙酸浓度,并显著降低甲烷排放,减少能量损失。     

富硒豆的培养及其硒含量分析

为了开发新型富硒功能食品———富硒豆,研究了绿豆和大豆在不同含硒溶液中发芽生长情况。结果表明,20.00#g.mL-1的高浓度硒培养溶液会对绿豆和大豆的发芽生长产生明显毒性,且四价硒毒性更强,表现在四价硒培养的绿豆和大豆发芽率较六价硒低;分别在0～3.00#g.mL-1和0～6.00#g.mL-1的六价硒溶液培养下,绿豆和大豆发芽生长情况基本良好。采用氢化物原子荧光光谱法作外标标准曲线,并测定培养后的绿豆和大豆硒含量,结果20#g.mL-1的高浓度硒溶液培养的豆含硒量最高,为75.0273～102.2612#g.L-1。而在0～6.00#g.mL-1的六价硒培养条件下,绿豆和大豆的含硒量分别为7.5002～69.8483#g.L-1和11.1737～58.3926#g.L-1,且该硒含量范围适合富硒功能食品硒含量标准。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。     

酵母多糖处理对樱桃番茄抗冷性及品质的影响

以0.1、0.5、1.0、3.0 g · L-1的酵母多糖处理‘佳西娜’樱桃番茄,浸泡20 min后用聚乙烯（PE）保鲜袋包装（不封口）,置于（2 ± 1）℃、湿度85% ~ 95%的环境中贮藏,研究酵母多糖处理对番茄冷害以及生理生化和品质的影响。结果表明：酵母多糖处理能显著抑制樱桃番茄冷害的发生,延缓各品质指标的下降,同时可提高整个抗氧化酶系统的活性。在贮藏过程中,0.5 g · L-1质量浓度的酵母多糖处理的樱桃番茄受冷害程度最低、品质良好。     

酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。     

苹果蠹蛾半人工饲料与饲养温度的优化

为实现苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)的人工大规模饲养,对国外学者已经报道的半人工饲料配方进行改良,比较了取食5种饲料对苹果蠹蛾生长发育和繁殖的影响,并组建苹果蠹蛾在20、24、28、32℃条件下取食最优配方时的实验种群生命表。结果表明,来自我国西北疫区的苹果蠹蛾,在以豆粕、蔗糖、面粉、小麦胚芽为主要成分并添加酵母粉配制成的配方B饲喂后,与传统饲料配方相比显著影响苹果蠹蛾的发育历期和种群参数,提高存活率至50.24%、缩短幼虫发育历期至20.18 d、增加蛹重至26.54 mg,并提高单雌产卵量至85.30粒。生命表结果显示,24℃时种群趋势指数最高为16.42、单雌产卵量最大为62.44粒,28℃内禀增长率最高为0.08、雌性比例最大为0.55。表明我国西北疫区的苹果蠹蛾在24~28℃条件下,取食优化的半人工饲料利于其种群数量增加。