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31.
研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A (CctA)基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a (+),双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍(Ni)柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为:抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1:8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
32.
为建立倍他米松(BET)ELISA检测方法,先使BET与琥珀酸酐反应,再采用活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原;其次,利用免疫动物获得多克隆抗体,经Sephrose 4B-proteinA方法对抗体进行纯化;最后,建立倍他米松ELISA检测方法。结果表明,免疫抗原偶联成功,获得了亲和力较高的多克隆抗血清,间接竞争ELISA测定其滴度为102 400、IC15为6.60×10-5 ng/mL和IC50为0.97ng/mL。该方法适用于残留在动物性食品中的BET现场大批量检测。 相似文献
33.
Kanae SHIOKAWA Chandika D. GAMAGE Nobuo KOIZUMI Yoshihiro SAKODA Kenta SHIMIZU Yoshimi TSUDA Kumiko YOSHIMATSU Jiro ARIKAWA 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2016,78(2):221-230
The applicability of the recombinant LipL32 for serodiagnosis of leptospiral infection in field rodents was
assessed in this study. An immunodominant region of LipL32 was determined by monoclonal antibodies, and then,
truncated LipL32 (tLipL32) was designed to contain the region (87–188th amino acid). The tLipL32 was compared
between two recombinant expression hosts Escherichia coli and Pichia
pastoris in ELISA. With field rat sera, tLipL32 expressed by P. pastoris
(tLipL32p) had high antigenicity without background reactions, while tLipL32 expressed by E.
coli (tLipL32e) showed high background reactions, which were reduced by pre-adsorption of sera with
E. coli. To evaluate tLipL32-ELISA, field rat sera were tentatively divided into a
Leptospira infection positive (12 sera) and a negative group (12 sera) based on the results
from flaB gene PCR of kidney samples and WB with whole Leptospira cell.
Consequently, the sensitivity of tLipL32p-ELISA for field rat sera was 83% . A similar result was obtained
from tLipL32e-ELISA with adsorbed sera, (92%). However, sensitivity of tLipL32e-ELISA using sera without an
adsorption treatment was 50%. Regardless of the expression host, tLipL32-ELISA had 100% specificity and
sensitivity in experimentally infected laboratory rats. These results suggest that recombinant LipL32
expressed by P. pastoris is more applicable for serodiagnosis in field rats due to a lack of
background reaction. 相似文献
34.
Hiroshi BANNAI Manabu NEMOTO Koji TSUJIMURA Takashi YAMANAKA Ken MAEDA Takashi KONDO 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2016,78(2):309-311
To increase the sensitivity of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for equine herpesvirus type 4
(EHV-4) that uses a 12-mer peptide of glycoprotein G (gG4-12-mer: MKNNPIYSEGSL) [4], we used a longer peptide consisting of a 24-mer repeat sequence (gG4-24-mer:
MKNNPIYSEGSLMLNVQHDDSIHT) as an antigen. Sera of horses experimentally infected with EHV-4 reacted much more
strongly to the gG4-24-mer peptide than to the gG4-12-mer peptide. We used peptide ELISAs to test paired sera
from horses naturally infected with EHV-4 (n=40). gG4-24-mer ELISA detected 37 positive samples (92.5%),
whereas gG4-12-mer ELISA detected only 28 (70.0%). gG4-24-mer ELISA was much more sensitive than gG4-12-mer
ELISA. 相似文献
35.
36.
棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用 总被引:6,自引:1,他引:6
以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2~3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3~5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。 相似文献
37.
38.
采用单克隆抗体制备技术,建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,液氮保存4年后复苏,细胞在HAT选择培养基中生长旺盛,分泌抗体稳定,分别命名为YNF1,YNF2,YNF3,YNF4,杂交瘤细胞染色体数介于96~115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1∶80~1∶160和1∶5 000~1∶10 000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应,与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类,亚类及轻链分别为IgG1/λ,IgG2a/κ,IgG2a/λ,IgG1/λ。结果表明,4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株,可长期传代无限分泌单抗,是进一步研究猪瘟病毒和开发敏感、特异、快速诊断猪瘟试剂盒和试纸探针的免疫学特异性试剂来源。 相似文献
39.
40.
应用特异性强的间接酶联免疫法,同时检测4种硝基呋喃类代谢物、氯霉素(CAP)和氟苯尼考(FF),建立快速分析水产品中6种药物残留量的方法.样品用盐酸进行消化,再由乙酸乙酯提取,使用酶联免疫试剂盒进行检测.实验结果显示,6种分析物均在其线性范围内,线性系数均大于0.995.在加标浓度为0.1、0.5和1.5μg/kg的加... 相似文献