酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体的构建

利用重叠延伸PCR获得酿酒酵母基因沉默组件SADH2,经酶切与酿酒酵母穿梭质粒pYES2.0连接,构建酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体。经酶切及测序鉴定成功构建了ADH2基因沉默表达载体pSADH2。     

Integrated Expression of the Oenococcus oeni mleA Gene in Saccharomyces cerevisiae

Malolactic enzyme is the function enzyme which catalyses the reaction for L-malate converting to L-lactic during malolactic fermentation （MLF）. In this paper, researches concerning the malolactic enzyme gene mleA cloned from a patent strain Oenococcus oeni SD-2a screened in Chinese wine and integrated expressing in Saccharomyces cerevisiae were performed in order to carry out both alcoholic fermentation （AF） and malolactic fermentation （MLF） during winemaking, with a view to achieving a better control of MLF in enology. To construct the expression plasmid named pYILmleA, cloned mleA gene, PGK1 promoter, and ADH1 terminator were ligated and inserted into integrating vector YIp5. Yeast transformants were screened on SD/-Ura and identified by auxotrophic test, mating type test, and colony PCR. Target protein was detected by SDS-PAGE and the targeted gene integrated to the chromosome was detected by dot bloting hybridization. After the transformant was cultured in SD/-Ura adding glucose （10%） and L-malate （5 648 mg L-1） for 4 d, the culture supernatant was collected and L-malate and L-lactic acid contents were detected by HPLC. 1 278-1 312 mg L-1 L-lactic acids were detected, while the comparative drop rates of L-malate were 20.18-20.85%. L-malate and L-lactic contents of the transformants showed extra significant difference and significant difference with the control ones by t-test respectively. The result indicated that the functional expression was achieved in recombinants S. cerevisiae.     

南阳酵母原生质体制备与再生条件研究

研究南阳酵母原生质体形成与再生的最佳条件。获取原生质体采用酶法,再生采用双层高渗平板法,因素重要性分析采用正交试验。结果表明:菌龄10h,以2.0%蜗牛酶加0.5%纤维素酶的混合酶液进行酶解破壁,酶解温度30℃,酶解时间2.5h,以0.6mol.L-1蔗糖做再生培养基的渗透压稳定剂,原生质体形成率91.40%,再生率10.56%。不进行预处理,在试验条件下,对南阳酵母原生质体形成与再生影响因素依次为:菌龄>酶解时间>酶浓度>渗稳剂。     

芽孢杆菌、酵母菌及乳杆菌发酵饲料养殖凡纳对虾效果比较

为了探讨不同益生菌发酵饲料养殖对虾的效果,用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) 3种益生菌单一及联合发酵对虾饲料,投喂凡纳对虾(Penaeus vannamei) 28 d,分析对虾的存活、生长及饲料利用情况,检测对虾体内外弧菌(Vibrio)数量及非特异性免疫相关指标变化,同时比较不同组间养殖水体中氨氮及亚硝氮的浓度差异。研究表明,对虾摄食枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌及复合菌发酵饲料存活率均显著提高(P<0.05),提高率分别达到8.54%、8.54%和9.76%;枯草芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌发酵饲料能够显著提高对虾的体长增长率(P<0.05);嗜酸乳杆菌发酵饲料可显著降低对虾的饵料系数(P<0.05);投喂发酵饲料的各实验组养殖至第14、21天时的对虾肝胰腺中弧菌密度显著低于对照组(P<0.05);各实验组中,虾血清总蛋白含量显著高于对照组,投喂嗜酸乳杆菌发酵饲料能够显著提高过氧化物酶、超氧化物歧化酶及酚氧化酶活性(P<0.05),且在养殖末期,投喂不同益生菌发酵饲料均可不同程度地降低养殖后期水体中的氨氮和亚硝氮浓度。综上可知,3种益生菌单一或混合发酵对虾饲料对提高对虾存活率、促进生长及提高免疫力方面均有积极效果,但嗜酸乳杆菌用于对虾饲料发酵的综合效果最佳。本研究为益生菌发酵饲料在对虾健康养殖中的应用提供了理论依据。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

中国红豆杉紫杉烷10β-羟化酶的分子克隆及在酿酒酵母中的表达

天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1494bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9．42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-10β-羟化酶有92％的同源性。将这个cDNA片段连接在质粒pYeDP60上构建表达载体,导入相应的酵母表达菌株WHT和WVS进行表达,获得相应大小的蛋白表达条带,功能鉴定的工作正在进行中。     

Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸－乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因重组表达质粒的构建，利用来自重组质粒pLmleA的mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白，斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到     

酒精发酵非结构动力学模型及其参数估计

对1株产高浓度酒精的酿酒酵母的间歇发酵动力学进行了研究。建立了非结构发酵动力学模型, 以描述高基质(葡萄糖)和高产物(酒精)浓度条件下的酒精间歇发酵过程,采用改进遗传算法对非结构发酵动力学 模型中的参数进行了求取,并将该模型用于预测24．7％初糖浓度下的酒精间歇发酵,预测结果显示该模型可应用 于高基质(葡萄糖)和高产物(酒精)浓度条件下的酒精发酵过程。     

低能N+离子注入对酿酒酵母乙醇发酵活性的影响

[目的]研究低能N^＋离子注入对酿酒酵母乙醇发酵活性的影响。[方法]选取scerevisiaeAS2．399作为受体菌,经过不同剂量的低能N^＋离子注入后,确定最佳的注入参数,并研究离子注入对S．cerevisiae AS2．399乙醇发酵效率以及对乙醇发酵关键酶表达的影响。[结果]酿酒酵母As2．399在N^＋注入剂量为10×10^15 ions／cm^2条件下的存活率约为25％,传代培养后菌株发酵乙醇的产率约为0．42g/g（达到理论产率的84％）,相比于原始菌株有微弱提升,而与乙醇发酵相关的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶酶活值分别达到0．53和2．47μmol／ml·min,大于原始菌株的相应酶活。[结论]该研究结果可为采用低能离子注入技术对酿酒酵母改良,以拓宽其利用底物的广度和提高发酵乙醇的效率奠定基础。     

植物乳杆菌对大黄鱼非特异性免疫力的影响

[目的]研究益生菌植物乳杆菌P13对大黄鱼先天免疫力的影响。[方法]用舍植物乳杆菌P13的配方饲料喂养大黄鱼4周后,测定大黄鱼的非特异性免疫指标。[结果]合10^6-10^10cfu／kg Saccharomyces cerevisiae P13的配方饲料可明显提高大黄鱼的补体活性、溶菌酶活性、吞噬活性和头肾白细胞呼吸性。[结论]植物乳杆菌P13能增强大黄鱼先天免疫能力。