水稻种子总RNA提取质量问题的探究

水稻种子总RNA提取在水稻分子遗传基础实验中起着非常重要的作用,然而,高质量水稻种子RNA的获取难度高,极大阻碍了cDNA文库构建、RNA-Seq和基因表达分析等相关研究工作的开展和深入。为了探讨水稻种子总RNA提取的相关影响因素,寻找合适的水稻种子总RNA提取方式,本研究通过比较Trizol法、GeneMark试剂盒法和艾德莱试剂盒法3种不同的提取方式、不同的耗材处理方法、研磨方式等不同因素改进水稻种子总RNA的提取效果。不同的检测结果显示,艾德莱多糖多酚提取试剂盒能够提取到28S、18S条带完整、降解少和纯度高的水稻种子总RNA;不同耗材处理方法中,蛋白酶K处理过的耗材提取的总RNA比另外两种方法处理过的耗材提取的总RNA降解更少,28S和18S条带更清晰和完整、总RNA质量最高、效果最好;而研磨方式上,液氮冷冻研磨法能够有效抑制RNA酶对RNA的降解。本研究对水稻种子RNA提取过程相关因素的分析和改进,为促进以水稻种子为研究对象的分子实验奠定了一定的技术基础。     

非生物胁迫下青花菜LncRNA内参基因的筛选

长链非编码RNA在植物抵御逆境胁迫中起着重要作用。适宜的内参基因是准确评价其表达水平的基础。本研究利用实时荧光定量PCR技术检测16个青花菜LncRNAs表达水平,并通过geNorm、NormFinder、BestKeerper软件进行表达稳定性分析。结果表明：青花菜的16个LncRNAs在不同逆境胁迫下表达稳定性存在差异。其中在弱光胁迫条件下, XLOC_000400表达最稳定;在低温胁迫条件下 XLOC_030832基因稳定性最好;在干旱和渍水胁迫条件下最稳定表达的内参基因分别是 XLOC_007087和 XLOC_012179;高温和盐胁迫处理下最稳定表达的内参基因均为 XLOC_007980。 XLOC_010342和 XLOC_007980在青花菜不同逆境胁迫下的表达稳定性较好。研究结果可为准确定量青花菜不同逆境胁迫下的LncRNAs提供合适的内参基因。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

不同方法提取狗脊蕨叶片总RNA的比较分析

[目的]为构建狗脊蕨叶cDNA文库,保存珍贵基因资源,克隆和研究与有效成分合成相关的基因等提供技术参考。[方法]以狗脊蕨叶片为材料,采用CTAB法、一步法、酚-SDS法和RNA试剂盒提取分离法提取总RNA,通过比较分析确定最优方法。[结果]这4种方法都能提取出182、8 S的RNA,但CTAB法和试剂盒提取分离法的总RNA质量较高,CTAB法还提取出清晰的5S RNA。一步法和SDS法带型模糊,有降解现象。CTAB法提取的狗脊蕨叶片总RNA质量较好,28S1、8S和5S条带清晰,且无明显降解。CTAB提取法OD260/OD280的值在1.93~2.06,试验中其OD260/OD280值为2.012,接近2.0,纯度较高。一步法和SDS法OD260/OD280>2.0,试剂盒法OD260/OD280<2.0。[结论]CTAB法适合提取的狗脊蕨叶片总RNA,质量较好,可用于cDNA合成、文库构建等后续分子生物学试验。     

丹尼斯凤梨叶片总RNA提取方法的比较

以丹尼斯凤梨(Guzmania‘Denise’)叶片为材料,利用Trizol试剂快速提取法、异硫氰酸胍法、苯酚法和CTAB法提取丹尼斯凤梨总RNA,通过RNA的产率、纯度、电泳图等分析来确立适用于丹尼斯凤梨总RNA分离的方法。结果表明,Trizol法提取的RNA具有28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA3条较清晰的条带,很少有降解,具有较高的纯度,其他3种方法获得的RNA纯度较低、降解严重,有较多小分子和盐存在,RNA无明显条带出现,而是以小分子RNA弥散状分布。     

水稻转录因子OsWRKY68蛋白质的表达特征及其功能特性

【目的】 水稻中有近百个WRKY转录因子家族成员,其中很多与生长发育、生物与非生物逆境胁迫应答有关。河北农业大学生命科学学院分子生物学与生物信息学实验室（molecular biology & bioinformatics lab,MBB）前期发现OsWRKY68在水稻接种白叶枯病菌后诱导表达,本研究试图进一步探究OsWRKY68的功能。【方法】 采集水稻TP309不同生长发育时期的组织样品,包括萌发期、幼苗期、分蘖期、孕穗期和开花期的根、茎、叶、叶鞘、叶枕、穗子、花药、颖壳和种子,以及非生物胁迫（4℃、44℃、48℃、淹、NaCl、PEG、恒光和恒暗）和激素处理（脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯利）的叶片,提取总蛋白质,用水稻OsWRKY68蛋白质特异抗体,通过免疫印迹（western blot,WB）技术系统调查OsWRKY68蛋白质在水稻正常发育过程中不同时期、不同组织、非生物胁迫及激素处理条件下的表达特征。构建RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻TP309,对转基因植株进行PCR和WB鉴定,观察OsWRKY68 RNAi转基因植株的表型并测量其株高、分蘖数、穗长、小穗数和结实率等性状。【结果】 调查OsWRKY68蛋白质的表达丰度,发现OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育过程中基本呈组成型表达,且在大部分组织中表达丰度差异倍数不大,但在开花期的花药中OsWRKY68表达量高于成熟穗、穗轴和颖壳;在分蘖期和孕穗期的叶鞘中不表达,仅在开花期的叶鞘中表达;在孕穗期的幼穗中,随着幼穗长度的增加其表达丰度逐渐降低。调查水稻非生物胁迫和激素处理后OsWRKY68蛋白质的表达特征,发现盐胁迫后OsWRKY68蛋白质的表达丰度随时间延长持续下降,恒光处理后OsWRKY68蛋白质表达量持续上升,3 d时明显出现一条分子质量较大的条带（记作OsWRKY68 ⁺）,且表达量逐渐增加,茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和乙烯利（ethephon,ET）处理后同样也呈现OsWRKY68 ⁺蛋白质丰度的增加。对转基因植株进行鉴定和自交繁殖,对T₃代的4个OsWRKY68 RNAi转基因株系（Y316、Y317、Y326和Y337）进行PCR和WB鉴定,均表现阳性。在转基因植株中,OsWRKY68蛋白质的表达量均低于野生型TP309。对转基因植株进行表型观察和性状测量,发现与野生型相比转基因植株的株高降低、分蘖数和结实率下降等。 【结论】 OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育中发挥作用,敲低OsWRKY68蛋白质的表达能影响水稻的正常生长。OsWRKY68蛋白质可能参与盐、光照、茉莉酸甲酯和乙烯介导的信号转导过程。     

双链RNA分析技术在鉴定RNA病毒中的应用

ｄｓＲＮＡ技术是以无ＲＮＡ病毒或类似病毒因子侵染的植物组织中不含有容易鉴定的同原大分子的ｄｓＲＮＡ（＞０．１×１０６）存在为前提。在植物体内ｄｓＲＮＡ是ＲＮＡ病毒和类病毒因子存在的迹象，ｄｓＲＮＡ包括ｄｓＲＮＡ病毒的基因或ｓｓＲＮＡ病的复制中间型。ｄｓＲＮＡ在寄主组织相当稳定，可以用物理和化学的方法分离出来。叙述了ｄｓＲＮＡ技术用于植物病毒群、成员、同一病毒的不同株系、感染作物的新病毒及其复合侵染、类病毒、卫星病毒等的鉴定。证明该方法使用广泛、快速准确，不需要贵重设备，在一般实验室中即可进行。该方法有重要应用和学术价值，已引起植物病毒和植物病理学工作者广泛兴趣。     

侵染绿花椰菜的黄瓜花叶病毒（CMV）研究

从杭州市郊菜园表现严重花叶、矮化症状的绿花椰菜病株上获得一病毒分离物Ｃ－９３１。汁液摩擦接种６科２１种植物，Ｃ－９３１可侵染其中的６科１９种；体外抗性测定表明Ｃ－９３１的稀释限点（ＤＥＰ）为１０￣（－２），致死温度（ＴＩＰ）为５５－６０℃，２５℃体外存活期（ＬＩＶ）为４ｄ；提纯病毒粒体球形，平均直径２８ｎｍ；在琼脂双扩散反应中Ｃ－９３１能与ＣＭＶ抗血清呈阳性反应；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得其衣壳蛋白亚基分子量为２９ｋＤ；用ＣＦ－１１纤维素柱提取受侵植物组织中ｄｓＲＮＡ，电泳鉴定表明共有５个核酸组分，长度（ｋｂ）分别为３．３，３．０，２．２，０．９和０．３５．根据上述性状，Ｃ９３１被鉴定为黄瓜花叶病毒，且该分离物含卫星ＲＮＡ。     

犊牛血液RNA含量用作奶牛遗传标记的研究

本研究采用作试验改进的脲－酚－氯仿－醇－ＳＤＳ系统方法，对江西畜牧良种场奶牛一分场的黑白花奶牛群的５头公牛家系的１９１对母女牛进行了血液ＲＮＡ的测定，分析了被测奶牛血液ＲＮＡ含量的变化的规律性及其与产奶量的关系，建立了利用血液ＲＮＡ含量估测产奶量的回归方程。测定分析结果：试验牛血液ＲＮＡ遗传力（ｈ＾２）及其与产奶量的遗传相关（ｒＡ）分别为０．８５５８（Ｐ〈０．０５）与０．５８１７（Ｐ〈０．０５）