广东省猪PCV-2感染的调查

2005年-2006年,对广东省12个市（县／区）共40个猪场108头病例,应用病理学及病原检测方法对PCV-2感染情况进行调查。结果表明,PCV-2阳性44例,占总病例数的40．7％。从,10日龄到120日龄均有感染,以60日龄～70日龄多发。在PCV-2感染的病例中,混合感染占95．5％。以混合感染PRRSV（11例,25％）最多,混合感染APP次之（10例,22．7％）。另外,调查显示该病可全年发生,但5月份为发病高峰。     

PCV-2分离新方法的建立及广东株全基因序列的分析

利用体外环化的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因的感染性,建立一种分离PCV-2的方法。根据GenBank中PCV-2的基因序列,设计合成1对扩增PCV-2全基因组的特异性引物。通过PCR方法从广东发病猪病料扩增到PCV-2全基因组片段,将该片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得阳性重组质粒pM-DT-YF并测序。将所测序列与GenBank中发表的PCV毒株序列进行同源性比较。将质粒pMDT-YF大量扩增,经SacⅡ酶切质粒得到PCV-2全基因组,通过T4连接酶体外环化后,脂质体介导转染PK-15细胞,盲传8代。用间接免疫荧光抗体试验(IFA)可检测到特异性荧光。将转染细胞稀释后接96孔细胞培养板,培养3 d。用荧光定量法检测各孔的PCV-2拷贝数,选择拷贝数最大的细胞扩大培养,经IFA法测定病毒滴度显著增加。结果表明,利用具有感染性的体外环化的全基因组的克隆转染PK-15细胞,并通过选择压力可获得较高滴度的具有感染性的PCV-2。     

猪巨细胞病毒GX株gB基因的克隆与序列分析

从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒GX株,通过PCR扩增得到猪巨细胞病毒GX株gB基因的一个1736bp片段,扩增产物经克隆、测序,得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比,其同源性在97.8%～98.9%,与人巨细胞病毒分离株的同源性在32.0%～43.6%,表明gB基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中,GX株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而与人巨化细胞病毒差异较大。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位嵌入型S-层蛋白在副干酪乳杆菌中的表达与鉴定

【目的】构建新型猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)乳酸菌活菌疫苗载体。【方法】应用DNA重组技术将嗜酸乳杆菌S-层蛋白(SLP)基因及PEDV S2基因B细胞表位(EpitopeS2)融合基因(SLP-EpitopeS2)克隆到乳酸杆菌表达载体pTRK892中,构建重组载体pTRK-SLP-EpitopeS2,通过电转化方法将重组质粒导入副干酪乳杆菌中,获得重组副干酪乳杆菌。分别用SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)鉴定目的蛋白在副干酪乳杆菌中的表达。【结果】PCR结果显示,成功扩增出大小为1 400 bp的目的条带,与插入融合基因大小一致,双酶切结果出现大小分别为1 400和4 700 bp的2条带,基因测序结果显示无碱基缺失和突变等,从而确定重组质粒pTRK-SLP-EpitopeS2构建正确。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,在48 ku处出现与理论值大小一致的目的蛋白条带,表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳杆菌中得到有效表达。IFA结果显示,...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

猪德尔塔冠状病毒致病机理及防治研究进展

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。深入开展PDCoV的研究对该病的防控有重要意义。PDCoV基因组编码的4种结构蛋白、15个非结构蛋白和3个辅助蛋白在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。PDCoV致病机理复杂,笔者从其侵入宿主细胞以颉颃干扰素反应、诱导细胞凋亡、调控细胞自噬、抑制细胞焦亡途径来逃避宿主免疫应答,以及其他影响PDCoV复制的分子机制方面对其致病机理进行总结。PDCoV呈全球性流行趋势,常用S、M和N基因作为核酸检测和抗体检测靶标进行诊断。目前,尚未开发出针对PDCoV的安全有效的商品化疫苗和治疗方法,随着生物技术的发展,在灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、重组载体疫苗、病毒样颗粒疫苗和乳酸菌载体口服疫苗上取得一定进展,且广谱抗病毒药物、抗病毒分子蛋白和新型抗病毒技术在PDCoV抗病毒研究中显示了良好的应用前景。因此,笔者总结PDCoV编码蛋白功能、致病机理、诊断方法及PDCoV的疫苗开发和抗病毒治疗,以期为后续科学研究和有效防治提供借鉴。     

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和Hind Ⅲ双酶切的线性化pET-32a (+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D_{600 nm}值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37 ℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度＞95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10⁴U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为研究2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场是否有猪流行性腹泻病毒的感染与流行,对猪流行性腹泻病毒ORF3(Open reading flame 3)基因进行克隆及序列分析研究。通过从疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集小肠组织,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒的ORF3基因进行克隆。结果表明,所获得的ORF3基因ORF长675bp,编码223个氨基酸。通过DNAMAN软件分析,表明本研究中克隆的ORF3基因与CV777标准株(AF353511)的ORF3基因相似性为96.45%,与中国的NJ(KJ642645)的相似性最高,为99.41%,与attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%,而与CV777疫苗株(GU372744)相似性仅79.07%。系统进化树分析表明,该基因与中国毒株、韩国毒株以及美国分离株USA/Illinois 201/2014(KR265795)处于同一进化分支上,而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和欧洲的CV777标准株处于另一个进化分支上,说明该基因与中国毒株、韩国毒株的遗传距离最近。通过B细胞抗原表位预测分析,发现其氨基酸第65~68、114~116、137~140和150~154区域可能有潜在的优势抗原表位。成功克隆了猪流行性腹泻病毒ORF3基因,说明2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场存在猪流行性腹泻病毒的感染。