重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验

用由毕赤酵母表达的皮蝇素A（Hypdermin A，HA）蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛，了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，3周后抗体水平达到峰值，后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好，差异非常显著（P〈0．01）。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛，观察感染率和感染强度，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83．3％和36．3％（对照组为55．5％）；平均感染强度分别为6．5和4．2（对照组为13．0），差异不显著（P〉0．05）。免疫后，抗体水平上升，3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好，三组抗体水平差异非常显著（P〈0．01）。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。     

热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵母重组菌株经摇瓶诱导培养120 h后,培养上清的酶活力达到0.7 U/mL,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白质条带,进一步证明了分泌效率提高,该结果表明提高蛋白质的热稳定性可以作为提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌效率的一条有效途径。     

利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。     

凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达

[目的]明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA(LvcrustinA)在毕赤酵母菌中的表达情况,为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础.[方法]采用全基因合成法(PAS)合成LvcrustinA基因,然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα,所得重组质粒转化感受态细菌TOP10,以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转至毕赤酵母菌GS115;以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况,并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用.[结果]以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115,获得的重组菌株在30℃下摇床(220 r/min)培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA,且随培养时间的延长,其表达量逐渐增多.Western blotting鉴定结果显示,纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别.保护试验结果表明,融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力.[结论]利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA,且获得的LvcrustinA具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用.     

猪IL-18在毕赤酵母中分泌表达条件的优化

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高.     

HarpinXooc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌RS105菌株中扩增harpinXooc编码基因hrf2,将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游,获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析,在约18kD处有特异目标条带出现。Western blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpinXooc能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinXooc。     

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_GAP组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_AOX1诱导型和P_GAP组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除M...     

大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1在毕赤酵母中的表达与酶活分析

 为了探究大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1(exoglucanase)的酶活与催化机理,本研究在生物信息学分析的基础上,以大丽轮枝菌V991菌株为材料克隆了VdCBH1基因,进一步构建了pPIC9-VdCBH1重组质粒并转入毕赤酵母中进行表达,测定了重组VdCBH1蛋白的外切葡聚糖酶活性;将预测的VdCBH1催化残基位点进行突变,随后通过SDS-PAGE分析了重组VdCBH1蛋白及其催化残基位点突变蛋白的表达情况,并检测了VdCBH1催化残基位点突变前后的酶活变化。结果表明,VdCBH1基因编码区全长1 356 bp,编码451个氨基酸,蛋白理论分子量大小为48.574 kDa,理论等电点为4.29,N端前17个氨基酸为信号肽序列。保守结构域和进化树分析表明,VdCBH1蛋白含有GH7_CBH_EG保守结构域,该结构域是糖基水解酶7家族(Glycosyl hydrolase family 7,GH7)所特有的,与尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)的外切葡聚糖酶蛋白亲缘关系最近。重组VdCBH1蛋白具有典型的外切葡聚糖酶活性,而Glu233催化残基单突变与Glu228、Asp230和Glu233催化残基三突变蛋白的酶活明显下降。这表明催化残基Glu233在外切葡聚糖酶活性中发挥更为重要的作用,Glu228、Asp230则可能在其中起协同作用。本研究为进一步揭示VdCBH1蛋白的催化机制奠定了理论基础。     

里氏木霉木聚糖酶XYN Ⅱ基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0.     

噬菌体裂解酶Lysep3的毕赤酵母重组表达和活性分析

试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZαA。经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33。重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5 L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化。通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析。结果显示,重组菌在5 L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L。抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6~1.7个数量级。此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024 μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75%;溶血性分析显示,1 024 μg/mL浓度下溶血率仅为1.58%。上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性。从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力。