罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70（rtHsp70）,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明：克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

利用毕赤酵母系统表达O型口蹄疫病毒VP1基因,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。将VP1基因克隆入毕赤酵母分泌性表达载体pPICZα-C中,获得重组表达载体pPICZαC-VP1。将重组质粒pPICZαC-VP1线性化后,用电穿孔法转入酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠,然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明,酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达

以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因在毕赤酵母中的表达

白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害东南亚及北美洲沿岸养殖对虾的重要病原。近十年来,国内外对该病毒的形态结构、基因组全序列、宿主范围、传播途径、致病性和组织细胞特异性等作了大量的研究[1-7],并已确定该病毒的侵染与其囊膜蛋白vp28有关[8]。实验根据已发表的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因序列[9]设计一对引物,通过PCR扩增出该囊膜蛋白的基因片段。将该片段连接到毕赤酵母表达载体pPICZ上,在大肠杆菌中筛选到含目的基因的重组质粒pPICZVP28,用电穿孔法将重组质粒转化到毕赤酵母菌株X33中,获得了转化子X33 …     

萝卜过氧化物酶基因RsPrx1在毕赤酵母中的表达及其抗性

从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得过氧化物酶基因RsPrx1的cDNA,将其克隆到pGEM-T载体中,并构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9KH-RsPrx1。用L iC l法转化野生型毕赤酵母GS115获得重组转化子。用不同浓度的NaC l和H2O2处理重组毕赤酵母转化子,结果表明该转化子具有一定的抗盐和抗氧化能力。建立了RsPrx1重组毕赤酵母表达体系,能够有效表达具有生物活性的外源过氧化物酶。     

人源明胶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]利用毕赤酵母重组获得明胶蛋白。[方法]构建基因工程菌,利用甲醇诱导表达。[结果]LC-MS/MS检测到了明胶蛋白。[结论]微生物重组表达特定分子量大小的明胶是可行的。     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达的研究

为了利用组成型表达方法在Pichia pastoris SMD1168中表达抗菌肽Cecropin AD,利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,将基因片段SH插入到载体pGAPZa-A中命名为pGAPZa-ASH,将pGAPZa-ASH电转至Pichia pastoris SMD1168中,Zecion抗性筛选阳性重组子。用Tricine-SDS-PAGE分析表达状况,琼脂扩散法检测蛋白的抑菌活性。结果表明:在3.0ku处有目的条带,并且表达产物抗菌肽Cecropin AD有生物活性。研究利用组成型表达方法在毕赤酵母菌株成功表达了抗菌肽Cecropin AD。组成型表达方法在本研究中成功的应用,为以后的实验研究奠定了理论基础。     

牛β-防御素BNBD5基因在毕赤酵母中的表达

本研究在本实验室成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库的基础上,旨在通过对牛β-防御素基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理.以牛β-防御素BNBD5基因作为乳房炎抗性的候选基因,通过克隆该基因的编码区,成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5,并采用毕赤酵母表达系统表达了BNBD5蛋白.该结果为今后BNBD5抗体的制备奠定了基础.     

功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测

[目的]检测克隆猪α干扰素基因（IFN-α基因）在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素（PHA）诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。     

特异腐质霉来源漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6～11的范围内酶的相对活力均在70%以上。