Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.     

前导肽区域N-糖基化影响骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的分泌表达和热稳定性研究

骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量较低,不能满足产业化需求。为提高骆驼凝乳酶原的表达量,采用定点突变的方法,分别在其前导肽的第11、26、34、35、38、39位氨基酸处引入1个N-糖基化位点,构建成6种骆驼凝乳酶原的N-糖基化突变体：chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39,并分别导入到毕赤酵母中进行分泌表达。测定和比较了野生型（wild）和各突变体骆驼凝乳酶原的表达量。Chy34、chy35、chy38和chy39的表达量显著提高,其中chy34的表达量最高。6种突变体均保持前导肽自切割活性。在50 ℃保温8 h,wild酶活完全丧失,而突变体仍有20%~80%的相对酶活,表明6种突变体的热稳定性均显著增强。研究结果为提高骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量和增强热稳定性提供了新的研究思路。     

里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN II)的cDNA序列。测序结果表明,XYN II的cDNA基因开放阅读框长度为669 bp,编码223个氨基酸,N端1~19个氨基酸为潜在的信号肽序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xynII)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYN II并分泌到胞外。发酵液中的酶活在诱导培养60 h达到1.45 IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0。     

外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统,在其乙醇氧化酶 ＡＯＸ１基因启动子的控制下,某些外源基因（如 ＴＮＦ、ＥＧＦ等）的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统,但有许多因素影响外源基因在其中的表达,包括外源基因的拷贝数及整合到酵母染色体的位置和方式、ｍＲＮＡ的５’和３’非翻译区（ＵＴＲ）、转录起始密码子的上下文、外源基因Ａ＋Ｔ的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成分和培养条件等。在应用该表达系统过程中,这些因素都需加以考虑。本文将就这些因素作一概述和讨论,以有利于提高外原基因在该系统中的表达水平。     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性

根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

重组毕赤酵母产木聚糖酶条件的优化

对基因工程菌Pichia pastoris GS115-ATx在摇瓶发酵水平产木聚糖酶条件进行了优化.结果表明,该基因工程菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳氮源为牛肉膏,有机氮源促进产酶的效果优于无机氮源.GS115-ATx产木聚糖的最佳甲醇诱导浓度为0.5%,在甲醇诱导的同时补加0.5%甘油能显著提高木聚糖酶的活性.研究发现,吐温20、吐温80、甜菜碱等表面活性剂均具有促进基因工程菌GS115-ATx产木聚糖酶的作用,其中甜菜碱的作用效果较佳.经SDS-PAGE电泳分析,GS115-ATx产生木聚糖酶的分子量约为19.0 kDa.发酵液上清中的木聚糖酶活性在甲醇诱导培养96 h后达到最大值.     

一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶rPrA经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了rPrA对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况.结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分子量约为44 ku,在pH3.0的发酵条件下酶活最高,可达46.92U/mL.该酸性蛋白酶的最适pH值为3.0,最适温度为35℃.Mn2+对该酶活性有激活作用,多种金属离子对该酶有抑制作用;0.1 mmol/L的Pepstain A即可完全抑制酶活,说明此重组酶的活性中心有天冬氨酸残基.对大豆蛋白和酪蛋白的初步水解试验可知,当E/S为4 000 U/g时,此重组酶对大豆分离蛋白和酪蛋白的水解度分别为9.0％和8.34％.优化发酵条件以及与多种蛋白酶进行复配,该重组蛋白酶将在蛋白水解中有很好的应用前景,有望应用到畜禽饲料加工行业.     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。