Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达与性质测定

碱性蛋白酶作为广泛应用的蛋白酶之一，具有重要的工业应用价值。发掘优质的碱性蛋白酶基因，实现其高效表达，有助于更好的满足工业应用需求。分别将Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana来源的碱性蛋白酶基因pa1及pa2与表达载体pPIC9连接，并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。对于纯化后的重组蛋白PA1及PA2的酶学性质进行测定，二者最适pH均为8.5，最适温度均为60 ℃，与同类酶相比具有一定的优势；PA1及PA2的温度稳定性较好，50 ℃下酶活保持稳定，60 ℃下处理10 min，二者均保持70%左右的酶活；PA1及PA2的pH耐受范围宽泛，在pH 4.0~11.0的环境中处理1 h，均能保持80%以上的活性。此外，PA1及PA2对于表面活性剂和还原剂也表现出一定的耐受性。这些性质都表明PA1及PA2是具有工业应用潜力的优质碱性蛋白酶。     

Neosartorya fischeri P1来源的外切聚半乳糖醛酸酶异源表达及性质研究

聚半乳糖醛酸酶在食品和饲料行业具有很大的应用价值,发现新的聚半乳糖醛酸酶不仅能够补充该酶的相关信息,还能为工业应用提供更多选择。从一株嗜热费希新萨托菌(Neosartorya fischeri P1)的基因组中克隆得到一个外切聚半乳糖醛酸酶基因(Nf-pg),将Nf-pg在毕赤酵母GS115中进行异源表达,重组酶Nf-PG纯化后进行性质测定。Nf-PG在p H 4.5和55℃时活性最高,在p H 2.0~9.0具有较好的稳定性,50℃热处理60 min仍能保持80%的剩余酶活;去除N-糖基化的酶蛋白Nf-PG-D最适温度为50℃,热稳定性降低,最适p H和酸碱稳定性无明显改变。产物分析证明Nf-PG是严格的外切聚半乳糖醛酸酶,优异的性质使其成为食品加工行业的良好选择。     

Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究

采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响.     

前导肽区域N-糖基化影响骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的分泌表达和热稳定性研究

骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量较低,不能满足产业化需求。为提高骆驼凝乳酶原的表达量,采用定点突变的方法,分别在其前导肽的第11、26、34、35、38、39位氨基酸处引入1个N-糖基化位点,构建成6种骆驼凝乳酶原的N-糖基化突变体：chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39,并分别导入到毕赤酵母中进行分泌表达。测定和比较了野生型（wild）和各突变体骆驼凝乳酶原的表达量。Chy34、chy35、chy38和chy39的表达量显著提高,其中chy34的表达量最高。6种突变体均保持前导肽自切割活性。在50 ℃保温8 h,wild酶活完全丧失,而突变体仍有20%~80%的相对酶活,表明6种突变体的热稳定性均显著增强。研究结果为提高骆驼凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量和增强热稳定性提供了新的研究思路。     

重组毕赤酵母产木聚糖酶条件的优化

对基因工程菌Pichia pastoris GS115-ATx在摇瓶发酵水平产木聚糖酶条件进行了优化.结果表明,该基因工程菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳氮源为牛肉膏,有机氮源促进产酶的效果优于无机氮源.GS115-ATx产木聚糖的最佳甲醇诱导浓度为0.5%,在甲醇诱导的同时补加0.5%甘油能显著提高木聚糖酶的活性.研究发现,吐温20、吐温80、甜菜碱等表面活性剂均具有促进基因工程菌GS115-ATx产木聚糖酶的作用,其中甜菜碱的作用效果较佳.经SDS-PAGE电泳分析,GS115-ATx产生木聚糖酶的分子量约为19.0 kDa.发酵液上清中的木聚糖酶活性在甲醇诱导培养96 h后达到最大值.     

重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性

根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoR I和Not I双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His^ Mut^ 重组子。0．5％甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS—PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6．0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg／L。