植物防御素基因alfAFP(M. sativa)在毕赤酵母中的分泌表达及对水稻病原菌的抑制

 【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母（GS115）,再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5 kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP在酵母中成功诱导表达,并对水稻测试病菌具有一定的抑制活性,预示着alfAFP防御素基因在水稻抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

Expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris

AIM: To study the expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris and to obtain high-level expressed recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity. METHODS: HBV core gene was amplified by PCR from plasmid pHBV1 which contained HBV whole DNA sequence. The PCR product was cloned into pGEM-T vector by TA cloning strategy. After confirmed by DNA sequence analysis, the gene of interest was inserted into the yeast expression vector pPIC9. The recombinant plasmid pPIC9-cAg was constructed and transformed into GS115 by electroporation. The recombinant yeast GS115 was induced by 0.5% methanol. The expressed product was analysed by SDS-PAGE,Western blot and ELISA. RESULTS: The restriction analysis and DNA sequence analysis proved that HBV core gene had already been cloned to yeast expression plasmid pPIC9. The expressed HBcAg existed in SDS-PAGE. Good immunoreactivity and high specificity of the recombinant HBcAg have been proved by ELISA and Western blot. The titre of the recombinant HBcAg in the cell lysate was 1∶12 800. CONCLUSION: The recombinant plasmid pPIC9-cAg was successfully constructed. The recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity was successfully expressed in Pichia pastoris expression system and can be applied to further developing HBcAb immunoassay.     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

抗脂肪细胞40 000特异膜蛋白scFv-Fc融合抗体毕赤酵母表达载体的构建

采用RT—PCR方法从人外周血淋巴细胞克隆IgG1 Fc片段基因，经序列分析表明，该Fc片段基因长699bp，具有完整的铰链区、CH2和CH3结构区，与GenBank中人IgG1重链Fc片段基因序列完全相同。将Fc片段基因与pPICZaA酵母载体连接先构建pPIgG1质粒，然后将抗脂肪细胞40000特异膜蛋白的噬菌体scFv抗体基因插入到pPIgG1质粒，构建pPIgG1-scFv酵母表达载体。序列分析表明，scFv基因与Fc片段基因拼接正确，阅读框正确无误，表明成功构建了抗脂肪细胞40000特异膜蛋白scFv—Fc融合抗体毕赤酵母表达载体。本试验为下一步在毕赤酵母中大量表达与IgG结构相似、具有较高亲和力和生物活性的scFv—Fc融合抗体分子奠定了基础。     

Transferase activity of GhCesA2 (putative cotton cellulose 4- β -glucosyltransferase) expressed in Pichia pastoris

GhCesA2 is a cotton (Gossypium hirsutum) homologue of the bacterial cellulose synthase gene that encodes cellulose 4--glucosyltransferase. The central catalytic region of GhCesA2 was expressed as a soluble protein in the methylotrophic yeastPichia pastoris. The molecular size of the recombinant protein was 100kDa, which decreased to 85 kDa after treatment with endoglycosidase H. The recombinant GhCesA2 catalyzed transfer of glucose from UDP-glucose into unknown products in the presence of an extract of cotton hypocotyls, but the products were not-1,4-glucan.     

家蝇幼虫防御素基因MddⅠ在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性鉴定

根据家蝇幼虫防御素基因(MddⅠ)序列,设计合成含有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的特异性引物,PCR扩增出MddⅠ基因全长序列。克隆并测定序列后,构建真核表达质粒pGAPZαAMddⅠ,将其在毕赤酵母(P.pastoris)GS115中分泌表达,并对表达产物进行抑菌活性分析。结果表明,Mdd 1基因在P.pastoris如中成功表达,分子量约为10.3 kDa,抑菌结果显示MddⅠ基因的真核表达产物对猪源链球菌有抑制作用。该试验成功构建了表达MddⅠ基因的P.pastoris菌株,为进一步研究MddⅠ真核表达产物的生物学活性和免疫学活性奠定了基础。     

毕赤酵母植酸酶基因工程菌高密度培养及诱导表达

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度发酵培养方式和植酸酶基因高效表达策略.采用逐步增加流加方式进行高密度培养,结果发酵液中细胞干重达到64g/L.通过在线检测细胞消耗甲醇的MSUR,估算细胞在单位时间内对甲醇需求量,从而确定甲醇流加速率,采用此种方法可使重组毕赤酵母高水平表达植酸酶,最终发酵上清液中总蛋白量为8.58 g/L,植酸酶活力达到853 U/mL.     

透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达.转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。