烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

重组毕赤酵母高产木聚糖酶菌株的筛选及诱导条件优化

[目的]筛选重组毕赤酵母高产木聚糖酶菌株并优化其甲醇诱导条件。[方法]用不同浓度的G418 YPD平板筛选高拷贝转化子,不同时间间隔添加不同浓度的甲醇进行木聚糖酶诱导表达。[结果]在G418浓度为10.0 mg/m l时,筛选得到产酶活力最高的16号菌株,以0.5%甲醇于30℃诱导产酶,第6天时酶活力达到最高,为826.2 IU/m l,木聚糖酶比活力达5 229.1 IU/mg;该菌在诱导时间间隔为12 h、诱导浓度为0.8%时,产酶量高且稳定。[结论]该菌是甲醇依赖型的高拷贝高酶活菌株。     

猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

 【目的】猪表皮生长因子（pEGF）具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能，从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF 基因为模板，用PCR扩增获得pEGF-6His片段，将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌，用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，纯化产物用抗His-tag 的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子，甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观察到印迹条带。氨基端氨基酸测序发现纯化的表达产物含有2条肽链，其N-端15个氨基酸的序列分别与天然的pEGF以及Glu-Ala -pEGF的序列相同。体外生物活性检测结果表明，纯化的表达产物对BALB/c 3T3细胞具有显著的增殖作用。【结论】本研究获得了能高效表达具有生物学活性的重组猪表皮生长因子的基因工程菌。     

抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析

为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中.在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5 α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17 μg/mL和4.55 μg/mL.     

环状抗菌肽cyclopsychotride在毕赤酵母X-33中的表达及其活性鉴定

为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。     

小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1在毕赤酵母中表达的探索

以已构建的含有小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的重组质粒pGEM-XYGluD3-LMWGS1为模板,利用设计的序列特异引物,扩增基因XYGluD3-LMWGS1编码区,构建成巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-XYGluD3-LMWGS,将其线性化后用电激法导入甲醇型酵母（Pichia.pastoris）菌株GS115中;利用pPIC3.5K特征引物进行PCR鉴定,筛选得到重组转化子,将重组转化子进行蛋白诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,XYGluD3-LMWGS1基因未能在毕赤酵母中成功表达。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

膜醭毕赤酵母对侵染苹果的扩展青霉拮抗作用研究

通过牛津杯法测定不同浓度膜醭毕赤酵母对扩展青霉体外抑制作用,将扩展青霉分别接入膜醭毕赤酵母和无菌水处理（对照组）的苹果,统计发病率和病变直径,结合顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）检测膜醭毕赤酵母拮抗组和对照组苹果的挥发性物质。结果表明,酵母在10⁸ CFU/mL时抑菌圈最大（25.4 mm）,并能显著抑制扩展青霉的孢子萌发率和芽管长度。培养10 d,酵母拮抗组的苹果发病率为10.6%,显著低于对照组（92.2%）。HS-GC-IMS共定性出38种挥发性成分,主要为酯类及醇醛化合物。对照组中丙酸乙酯、苯乙烯等含量显著高于酵母拮抗组。10⁸ CFU/mL 膜醭毕赤酵母细胞悬浮液能够明显抑制扩展青霉和有效防治苹果采后青霉病。     

基于~(60)Co-γ射线辐照的木糖乙醇发酵差异性突变菌株筛选及其发酵特性

本研究利用60Co-γ辐射源对树干毕赤酵母CICC1960进行辐照诱变,获取木糖乙醇发酵优良菌株和差异性突变菌株群体,为进一步利用比较基因组学方法深入研究木糖乙醇代谢机制提供菌种材料。经筛选获得7株木糖乙醇转化差异性突变菌株,以乙醇木糖比为指标,可将各突变菌株的发酵能力由高到低排列为:a1、X4、i11、K2、X21、CICC1960、a11、c10,乙醇木糖比均值分别为0.3143、0.3037;0.2911、0.2678、0.2578、0.2311、0.2230、0.1220。其中菌株a1、X4、i11为优良菌株,菌株a1在发酵72h时乙醇产量达到顶峰15.6 g·L-1,高出出发菌株140%,乙醇木糖比高出出发菌株37.9%;菌株X4在发酵60h时乙醇产量达到顶峰15.4 g·L-1,高出出发菌株234.8%,乙醇木糖比高出出发菌株33.1%;菌株i11在发酵60h时乙醇产量达到顶峰14.8 g·L-1,高出出发菌株221.7%,乙醇木糖比高出出发菌株29%。     

一种酸性木聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达及体外活性评价研究

通过构建硫色曲霉酸性木聚糖酶基因xynA串联双拷贝工程菌,提高酶的发酵活力。10 L发酵罐中,双拷贝菌株发酵活力达3 574 U/mL。重组木聚糖酶的最适催化温度为50℃,最适反应pH为2.2~3.4,在pH 1.7的酸性缓冲液下保持100 min,酶活残留70%以上。重组木聚糖酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有较好的耐受性。该木聚糖酶在低pH条件下的高催化活性、耐酸性及蛋白酶耐受性,使之具有较好的应用前景。通过体外模拟猪胃肠道环境以快速评价重组酶的作用效果。试验以小麦型日粮作为基础日粮,设计4个处理组,重组酶的添加量分别为0 U/kg、2 000 U/kg、4 000 U/kg和6 000 U/kg,每个处理5个重复,使用SDS\|Ⅱ单胃动物仿生消化系统模拟猪的胃肠道环境消化试验日粮,消化后的残渣烘干后测定其总能、粗蛋白质、中性洗涤纤维含量以计算其消化率。结果表明,添加重组酸性木聚糖酶显著提高了总能、粗蛋白质（线性和二次;P<0.01）和中性洗涤纤维的消化率（线性和二次;P<0.05）。重组酶的最适宜添加量为4 000 U/kg。