里氏木霉木聚糖酶XYN Ⅱ基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0.     

HarpinXooc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌RS105菌株中扩增harpinXooc编码基因hrf2,将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游,获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析,在约18kD处有特异目标条带出现。Western blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpinXooc能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinXooc。     

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_GAP组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_AOX1诱导型和P_GAP组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除M...     

Expression,purification and activity detemination of recombinant human keratinocyte growth factor in Pichia pastoris

AIM:To determine the conditions of recombinant human keratinocyte growth factor(hKGF) expression for large-scale production using Pichia pastoris(P.pastoris). METHODS:The DNA fragment encoding hKGF mature peptide was artificial synthesized. This artificial gene, which consisted of 20 codons of preference in P. pastoris, was cloned into secretory expression vector pPICZαA and transformed into P. pastoris X-33 strain. Under the optimal conditions in a 5 L fermentor, the target protein was purified using the combination of ultrafiltration and chromatography. The pro-proliferative activity of this protein for rhesus monkey lung epitelial cell line 4MBr-5 was detected by MTT assay. RESULTS:After 60 h of fermentation induced by methanol at 20℃, the expression level of recombinant hKGF was up to 14.1% of the total supernatant proteins. Subsequent filtration through heparin affinity chromatography and Sephadex G-25 yielded 12 mg/L target protein with purity > 95.0%. The glycosylated hKGF stimulated the proliferation of 4MBr-5 cells in vitro and its ED₅₀ was 57μg/L. CONCLUSION:The glycosylated hKGF was successfully expressed using P. pastoris and was able to improve the proliferation of 4MBr-5 cells in vitro.     

源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质分析

β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础.     

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

米黑根毛霉脂肪酶的克隆表达及发酵条件优化

米黑根毛霉脂肪酶RML是一种重要的工业用酶,具有非常广泛的应用前景。本研究将人工合成的RML基因rml克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选阳性重组工程菌。工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定,表明脂肪酶RML在毕赤酵母中获得高效表达,且蛋白分子大小与预期一致。进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为：甘油4.0%,（NH4）2SO45.000 g/L,CaSO40.465 g/L,K2SO49.100 g/L,MgSO4.7H2O7.450 g/L;培养条件为：pH值6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24 h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116 U/ml,比优化前提高了3.14倍。     

低pH值处理技术在树干毕赤酵母酒精连续发酵中的应用

[目的]解决连续发酵中杂菌污染的问题。[方法]树干毕赤酵母（Pichia stipitis）二级连续发酵戊糖己糖时采用低pH值处理技术来抑制杂菌。[结果]采用低pH值处理技术后,以15 g/L木糖和30 g/L葡萄糖混合物为发酵底物,发酵温度（35±1）℃,底物流加速度30 ml/h,二级连续发酵液中酒精平均浓度为15.22 g/L,还原糖利用为95.66%。该系统在连续发酵22 d的运行中从未发现染菌现象,发酵操作相当稳定。[结论]树干毕赤酵母对低pH值处理有良好的驯化适应性,pH值为2.40~3.60的处理条件对树干毕赤酵母完全可行。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达

通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%.