巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pastoris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.     

肉毒毒素重组抗原表达系统研究进展

肉毒中毒是肉毒杆菌引起的一种致死性的神经麻痹性疾病,应对内毒中毒的最有效方法是预防或疫苗接种,肉毒毒素Hc段是研制亚单位疫苗的首选.通过基因重组技术能够将肉毒毒素Hc片段在大肠杆菌或酵母表达系统中进行大规模表达.阐述了这2种表达载体在肉毒毒素亚单位疫苗的研制及发酵生产情况.     

糖化酶工业株的鉴定及糖化酶基因的克隆

对4种糖化酶工业株的rDNA片段进行克隆,在对比其rDNA-ITS1序列与GenBank数据库的基础上,结合形态学观察对菌株进行了鉴定。结果显示,4种菌株分别为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉和灰色小克银汉霉。通过Me-gAlign得到的进化树表明,前3种菌株亲缘关系较近,三者与灰色小克银汉霉的亲缘关系较远。进一步克隆了黑曲霉、无花果曲霉和米曲霉的糖化酶基因,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。     

弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达

以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍.     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。     

斑点叉尾(鱼回)LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

LEAP-2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2) 抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,其生物学活性来自成熟肽区域,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。本文以斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) LEAP-2成熟肽(mLEAP2)为研究对象,拟通过建立毕赤酵母表达系统,实现mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达,以期获得具生物学活性的重组体mLEAP2 (rmLEAP2),为进一步研究其功能和扩大制备奠定基础。首先以既有的斑点叉尾鮰mLEAP2的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板,通过PCR扩增,获得5’端含EcoRⅠ酶切位点、3’端含NotⅠ酶切位点及6×his标签的LEAP-2成熟肽基因mLEAP2,然后将其与真核表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”;电转化至毕赤酵母GS115细胞中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选,获得高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/m条件下,以0.5%的甲醇对其诱导表达120 h;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,通过MALDI-TOF/TOF质谱对纯化产物的结构进行分析和鉴定。结果表明：表达的重组体蛋白为预期的目的蛋白rmLEAP2,其表达量约2.2 mg/L;另一方面,抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。     

嗜热子囊菌JCM12803来源的阿魏酸酯酶FAE-2515酶学性质研究

阿魏酸酯酶广泛应用于食品、药品、饲料及造纸等行业,挖掘适用于工业化的阿魏酸酯酶至关重要。从嗜热真菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆得到一个阿魏酸酯酶基因FAE-2515,经基因序列分析,FAE-2515 cDNA全长为1 581 bp,编码526个氨基酸和1个终止子,理论分子量大小为57 kDa,等电点为5.08。将FAE-2515成功地在毕赤酵母中实现高效异源表达,通过对重组蛋白进行酶活测定,比活为（53.653±3.451）U/mg,Kcat/Km值为1.423,最适pH为6.0,最适温度为55℃,60℃处理1 h之后还能保持60%的酶活,热稳定性较已报道的同类酶更为稳定。以阿魏酸甲酯为底物时酶活表现为最高,以硝基苯棕榈酸酯为底物时几乎没有酶活。金属离子K+、Ca2+、Na+对该酶有显著的促进作用,Fe3+、Zn2+对该酶有轻微抑制作用,Mn2+、Cu2+对该酶有显著的抑制作用。综上,该酶在造纸工业和动物饲料制备工业中具有一定优势。     

拮抗菌与病原菌处理对采后桃果实多酚氧化酶、过氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶的诱导

 Pichiamembranefaciens能有效抑制桃果实采后软腐病。笔者观测和比较接种拮抗酵母菌P .mem branefaciens和软腐病菌Rhizopusstolonifer对采后桃果实多酚氧化酶 (PPO)、过氧化物酶 (POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的诱导情况。试验结果表明 ,桃果实接种P .membranefaciens +R .stolonifer 2 4h后 ,PPO和PAL活性开始升高 ,并在整个试验过程中一直保持较高的水平。只接种R .stolonifer也能诱导桃果实PPO和PAL活性的增加 ,但效果不如接种拮抗菌 +病原菌的好。然而 ,接种拮抗菌 +病原菌和只接种病原菌对诱导POD活性都没有明显的作用。可以认为 ,拮抗菌诱导抗性相关酶活性的提高是发挥抑病作用的一种重要方式     

酵素菌生物有机鱼肥在水产养殖上的应用研究

为探讨自制环保酵素对水产病原微生物的抑制作用,该研究对其发酵菌株进行了分离。通过比浊法和平板划线法,确定自制环保酵素对水产病原微生物坎氏弧菌SP-1 (Vibrio campbellii SP-1)、哈维氏弧菌SP-1 (V. harveyi SP-1)、轮虫弧菌SP-1 (V. rotiferianus SP-1) 和嗜水气单胞菌245 (Aeromonas hydrophila) 的最低抑制浓度分别是体积分数是体积分数为11.5%、11%、6.2%和11%,最小杀菌浓度分别是体积分数为16%、16%、16%和12%。攻毒保护试验表明,自制环保酵素无菌上清液可使嗜水气单胞菌对斑马鱼 (Danio rerio) 的致死率降低 (90.5±6.49) %。pH、温度、蛋白酶敏感性试验显示自制环保酵素的主要抗菌活性物质为酸性物质,对加热和蛋白酶处理稳定。进一步从环保酵素中分离主要发酵菌株,通过ITS序列分析鉴定为库德毕赤酵母 (Pichia kudriavzevii)。研究结果可为自制环保酵素在水产养殖中对抗细菌性疾病的应用提供理论基础。