黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达

为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

重组葡萄糖氧化酶毕赤酵母高产菌株的高通量快速筛选方法

根据葡萄糖氧化酶的反应原理和毕赤酵母诱导表达的机制,本研究建立了葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株筛选方法。首先在MM平板中诱导重组子表达葡萄糖氧化酶,然后添加显色液,阳性酵母菌株周围可见显色圈。经过与传统液体培养筛选方法的比较验证,结果表明,该方法灵敏度高,稳定性和重复性好,筛选结果与传统方法一致。当葡萄糖氧化酶活力介于0–0.1 U/ml的范围内,显色圈的绝对面积与酶活力相关系数可达0.63。该平板筛选方法可以从大量毕赤酵母重组子中快速筛选出表达葡萄糖氧化酶的阳性菌株,并可方便地判断出各菌株之间表达水平的差异。同时,该方法也可为筛选其他重组酶毕赤酵母菌株提供参考。     

Expression and Characterization of a Thermostable Xylanase Gene xynA from a Themophilic Fungus in Pichia pastoris

The gene of xylanase (xynA) was amplified by RT-PCR from the total RNA of a themophilic fungus Thermomyces lanuginosus SY2. The sequence analysis showed that gene coding region of mature peptide contained 0.585 kb, which coded 194amino acids. The putative amino acid sequence and DNA sequence of xylanase from T. lanuginosus SY2 (GenBank no.:GU166389) were 98.97 and 99.49% identical to the other T. lanuginosus (GenBank no.: U35436). A recombinant plasmid pPIC9K-xynA was constructed by inserting gene xynA into Pichia pastoris secretory vector pPIC9K. Linearized pPIC9K-xynA was transformed into P. pastoris GS115 with the method of electroporation. The recombinant strain was identified by G418 selection and confirmed by PCR analysis. It was induced by 1.0% methanol at 28℃ to express the recombinant xylanase. The results showed that the recombinant xylanase was secreted into extracellular fermentation liquid. The highest enzyme activity of 113.5 IU mL-1 and protein content of 889.7 μg mL-1 were detected for 216 h of induction. The optimal pH value and temperature of the enzyme activity was 5.5 and 65℃, respectively. The xylanase activity retained above 80% from pH value 2.5 to 8.5 for 48 h. The enzyme activity was above 85% at incubation temperature of 55℃.     

猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)在毕赤酵母中的表达及抑菌活性鉴定

根据猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)的蛋白序列和毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过全基因合成法合成改造后的PLF-N基因片段,将其克隆到pGAPZα-A质粒中构建分泌型重组酵母表达载体 pGAPZα-A- PLF。pGAPZα-A- PLF 通过限制性内切酶Avr Ⅱ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168内。PCR检测结果发现,PLF-N基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在GAP启动子调控下,PLF-N重组蛋白获得分泌表达,其分子质量约为38 ku,上清表达量约为364 μg/mL。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,该表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、25.0 μg/mL。     

乳源降血压七肽基因在毕赤酵母中的表达研究

利用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达乳源抗高血压七肽,为大规模生产抗高血压肽奠定基础。根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了具有较高活性的抗高血压七肽串联基因序列。将串联基因克隆至表达载体pPIC9上,并转化毕赤酵母GS115,经PCR检测获得2株重组菌株。重组菌经甲醇诱导,表达的分泌蛋白经胰蛋白酶酶解,测定酶解产物抑制ACE酶活性。结果表明,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物抑制ACE酶活性达到65.12%。IC50值为0.0203 mg.mL-1。研究成功合成了串联的13拷贝抗血压七肽基因,并实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物具有抗高血压肽活性。     

优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵增香酿造爱格丽干白葡萄酒

【目的】研究优选发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵对‘爱格丽’（Ecolly）干白葡萄酒的增香作用,优化干白葡萄酒的酿造工艺。【方法】将发酵毕赤酵母菌株H5Y-28与酿酒酵母菌株F5以10﹕1、4﹕1、1﹕1、1﹕4、1﹕10比例接种,进行模拟葡萄汁的混合发酵,并以酿酒酵母纯发酵为对照,发酵过程中监测酵母的活菌数、总菌数,建立菌体生长动力学模型。按相同接种比例进行爱格丽干白葡萄酒的发酵应用,以酿酒酵母纯发酵和添加发酵毕赤酵母胞外酶处理作为对照,酿造次年4月,对所酿葡萄酒酒样进行香气的感官分析和GC-MS分析。【结果】菌体生长动力学表明,随着发酵毕赤酵母接种比例的升高,其存活数量和存活时间明显增加,但优选菌株H5Y-28的高比例（10﹕1、4﹕1）接种处理会降低酿酒酵母的最大生长数量。感官分析结果表明,混合发酵有利于增强‘爱格丽’葡萄酒的果香和花香,尤其是热带水果香气,但高发酵毕赤酵母接种比例（10﹕1）会给葡萄酒带来较强的生青味,而酒样1﹕1、4﹕1仅引入较弱的生青味。挥发性香气成分分析结果表明,品种香气成分的含量随着发酵毕赤酵母接种比例的升高而增加,尤其是萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物。此外,添加胞外酶能显著提高葡萄酒品种香气的含量,尤其是C13-去甲类异戊二烯化合物的含量（高于纯酿酒酵母发酵酒样90%）。混合发酵显著增加了酒样中发酵香气中的乙酸酯、C6-C12脂肪酸及其酯类、异戊醇与苯乙醇的含量。与单一酿酒酵母发酵酒样相比,1﹕1接种比例有助于提高酒样中26%品种香气成分和39%发酵香气成分的含量,尤其是显著地提高了中链脂肪酸乙酯的含量（40%）。【结论】毕赤酵母与酿酒酵母1﹕1接种处理不影响酿酒酵母生长,且具有较强的增香酿造潜力。     

纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp（GenBank登录号为EU368754）,编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。