卵形鲳鲹 JAK3 蛋白的原核表达与纯化

【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。     

玉米瘤黑粉菌SG200效应蛋白PEP1表达及生物信息学分析

运用生物信息学手段分析pep1基因结构,并根据GenBank中玉米瘤黑粉菌pep1 DNA序列设计引物,从玉米瘤黑粉菌SG200的基因组中扩增得到了pep1基因全长,构建了pET–28a–pep1重组表达质粒,选用大肠埃希菌BL21(DE3)作为宿主菌,以1 mmol/L IPTG诱导表达。SDS–PAGE检测结果表明,诱导表达产物大小与理论值(20 800)一致,说明pET–28a–pep1能够在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。     

三种酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

目的：比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性。方法：采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物,并分别测定它们的在不同pH下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe^{2 +}螯合能力。结果：表明三种酶水解物都有较高的溶解度(p＜0.01),胰蛋白酶产生的水解物溶解高度达94.8％(p＜0.05);水解物溶解度和乳化活性指数在pH4显著降低(p＜0.05)。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强,其中胰蛋白酶和胃蛋白酶抗氧化能力较强(p＜0.01)。结论：三种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物,并受浓度和pH的影响,它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。     

加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析

【目的】对加州鲈弹状病毒弱毒三水株(MSRV-SS-7)及其母源株(MSRV-SS)进行全基因组克隆和测序分析。【方法】采用分段扩增方法对MSRV-SS-7及MSRV-SS基因组核心序列进行PCR扩增,第1轮根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)基因序列(NC_008514.1)设计10对引物进行扩增并测序;在第1轮扩增产物测序、拼接基础上,设计8对引物进行第2轮扩增,拼接后获得基因组核心序列。同时用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得3′和5′末端序列。采用Vector NTI 8.0对基因组核心序列和末端序列进行拼接,获得基因组全序列,使用Clone Manager 8.0对MSRV-SS-7和MSRV-SS进行序列比对分析;同时使用DNAMAN将基因组G基因序列转换为氨基酸序列,并通过MEGA 5.0与其他鱼类弹状病毒的G蛋白氨基酸序列进行进化树分析。【结果】MSRV-SS-7及其母源株MSRV-SS基因组全长均为11 548 bp,包含N、P、M、G、L等5个结构基因,基因组结构为3′Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5′;MSRV-SS-7与MSRV-SS全基因组中共有10处核苷酸不同。G蛋白进化分析表明,MSRV-SS-7及母源株MSRV-SS与SCRV亲缘关系最近,且与鲈鱼弹状病毒属(Perhabdovirus)聚为一支。【结论】克隆分析了MSRV-SS-7的全基因组序列,可以用于后续活疫苗的开发。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

木薯(Manihot esculenta)AKT1基因的克隆及生物信息学分析

植物细胞中的K^+通道蛋白AKT1(Arabidopsis K^+transpoter 1)主要负责吸收K^+。本研究基于木薯基因组数据库信息,利用PCR技术从木薯中克隆一个MeAKT1基因,该基因全长2634 bp,编码877个氨基酸,生物信息学分析表明MeAKT1含有10个外显子和9个内含子,编码的氨基酸分子量为99.02 kD,等电点为8.43,属于稳定蛋白。MeAKT1包含有5个跨膜区域,N端含有1个Ion_trans结构域,C端有1个KHA结构域,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,进化树分析发现MeAKT1与蓖麻RcAKT1的亲缘关系最近。通过对MeAKT1蛋白的生物信息学分析有助于下一步深入研究MeAKT1在木薯耐贫瘠过程中的功能。     

花生栽野种间杂交异源多倍化早期世代基因表达变化分析

为了进一步认识花生种间杂交异源多倍体进化过程中的基因表达变化规律,采用cDNA-HFO-TAG技术,研究花生种间杂交组合(四倍体栽培种‘仲恺花4号’×二倍体野生种Arachis. diogio)杂种F_1和早期多倍体世代S0~S3的基因表达变化情况。14条HFO-TAG引物共扩增出121条cDNA片段,其中差异片段84个,主要包括三种类型:亲本转录物完全沉默(3个),双亲转录物在后代部分材料中沉默(59个)和新转录物激活(22个),上述变化在F1代即开始发生。筛选其中大小为500~2 000 bp的35个TDFs进行克隆测序,有27个和NCBI数据库中已录入的基因具有较高的相似性,包括抗逆相关基因(10条)、未知功能蛋白基因(8条)、能量与代谢相关基因(7条)和转录因子相关的基因(2条)。这些研究结果进一步表明在花生种间杂交异源多倍化早期发生着快速、剧烈的基因表达变化,从中获得的差异基因片段,有助于了解花生属种间杂交异源多倍化早期分子机制变化,这对有效利用野生花生种质优异基因具有重要意义。cDNA-HFO-TAG技术简单、有效且实用,完全适用于花生属基因表达变化研究,可以作为花生属及其它物种基因表达变化分析技术的有效补充。     

水稻OsABCC10基因的克隆及其功能分析

ABCC蛋白为ABC转运蛋白超家族中的一个亚家族,主要参与将各种分子从细胞质输出到外部介质或细胞器基质的过程。为了研究OsABCC10基因是否参与水稻Na+的运输,本研究从水稻基因组中克隆出OsABCC10基因,该基因cDNA全长4539 bp,编码1513个氨基酸。OsABCC10基因表达分析发现,其主要在水稻根中表达,表达量随盐处理浓度的升高及处理时间的延长而增强,表明OsABCC10基因的表达受盐胁迫的调控。亚细胞定位分析证实OsABCC10定位于液泡膜上。盐胁迫条件下,与野生型相比,osabcc10突变体表现出对盐更敏感,而且木质部汁液中Na+浓度升高。然而,当OsABCC10基因导入野生型酵母菌株BY4741表达时,与对照组实验相比,有OsABCC10表达的酵母细胞的生长受到了抑制。该结果与植物生理实验结果相反,这可能与OsABCC10蛋白在酵母中的定位有关。本研究初步推测OsABCC10基因参与水稻Na^+的转运,是一个新的耐盐基因。     

鹰嘴豆短肽的分步酶解法制备及其营养价值评价

以鹰嘴豆蛋白为原料,建立复合酶分步酶解法制备鹰嘴豆短肽的工艺。在鹰嘴豆蛋白碱性蛋白酶Alcalase水解的基础上,进一步采用中性蛋白酶和风味蛋白酶Flavourzyme继续水解鹰嘴豆蛋白碱性蛋白酶Alcalase酶解物,并对各影响因素进行研究,建立短肽得率与各影响因素的回归模型,利用高效液相色谱法和氨基酸自动分析仪等测定鹰嘴豆短肽的相对分子质量、氨基酸组成、一般营养成分,评价鹰嘴豆短肽的营养价值。结果表明,中性蛋白酶和风味蛋白酶Flavourzyme制备鹰嘴豆短肽的最佳工艺参数为:复合酶添加量5 678 U/g,pH 7.0,水解时间216 min,水解温度55℃,在此条件下,短肽得率为63.79%,与碱性蛋白酶Alcalase单独酶解相比明显提高,水解度为26.74%;大部分水解产物的相对分子质量低于1 000、脂肪含量低,蛋白质、必需氨基酸等含量丰富,与FAO/WHO推荐的成人需求量模式相比,其第一限制氨基酸是蛋氨酸和半胱氨酸,与学龄儿童需求量模式相比,其第一限制氨基酸是苏氨酸,氨基酸分分别高达138.18和103.25;必需氨基酸与非必需氨基酸比值(EAA/NEAA)为0.73,接近FAO/WHO参考标准值0.6。该研究为进一步开发利用和工业化生产鹰嘴豆短肽奠定了基础。     

病程相关蛋白在采后果蔬诱导抗病性中的研究进展

果蔬受到真菌、细菌或病毒侵染时,自身能诱导产生病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)。根据它们的结构亲缘关系和生物活性,PRs被分为17个功能家族。在控制果蔬采后病害的研究中,利用激发子诱导产生果蔬抗性已逐渐成为果蔬采后病害防治中一种安全、高效的保鲜方法,这也成为果蔬采后抗病研究的热点和发展趋势。本文综述了果蔬病程相关蛋白的分类、功能、诱导表达,以及蛋白组学技术在果蔬采后PRs表达水平上的应用,以期为果蔬病程相关蛋白的研究提供借鉴和参考。