小鼠角蛋白10(K10)基因启动子的克隆及活性分析

【目的】角蛋白10 (K10) 是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一,在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时,可以作为特异的启动子。本研究欲筛选K10较强的启动子片段,为研究K10以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组DNA,经质量鉴定后,采用PCR法扩增K10的6个不同片段（F1-F6）,并将其分别亚克隆到pMD18-T载体,经测序验证是否正确;将K10的6个亚克隆片段再克隆到pGL0载体中,产生pGL0 - F1-F6构建,用脂质体法转染293T细胞,转染结束后将细胞裂解,并通过双荧光素酶报告基因检测6个片段转染细胞后引起的荧光素酶活性变化,以筛选启动效果最好的启动子片段;用筛选到的K10启动子片段作为特异启动子,替换pGL0载体上的CMV强启动子,并与周期素依赖蛋白激酶5（CDK5）基因进行重组,形成pGL0-F-CDK5构建,用脂质体法转染小鼠皮肤角化细胞,待转染结束后,分别进行细胞爬片、细胞裂解和细胞总RNA的提取,之后用免疫荧光化学、双荧光素酶报告基因检测法和实时荧光定量PCR法检测CDK5的表达定位、表达水平及荧光素酶活性,以检测其在角化细胞中的启动效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最强的K10启动子片段,发现其可能的转录因子结合位点。【结果】PCR扩增、克隆得到K10启动子的6个片段（F1-F6）,片段大小分别为1 201、908、664、787、790、656 bp;质粒pGL0 - F1-F6分别转染293T细胞后,通过双荧光报告检测发现长度为787bp的F4启动子活性最强;但F1-F6启动子的活性均弱于pGL0-basic中CMV的启动活性;F4序列中含有基本启动子保守区域的共同序列即TATAAAA,经Promoter Scan分析发现F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多个转录因子的结合位点,这些位点利于K10在角化细胞中表达;pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后,通过荧光蛋白的表达检测载体上GFP报告基因的表达,发现pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起GFP的表达量明显强于pGL0-basic-CDK5转染组;同时用荧光素酶活性检测pGL0-F4-CDK5在角化细胞中的启动效果,结果发现pGL0-F4-CDK5转染组的荧光比值明显高于对照组,差异显著（P＜0.01);经实时荧光定量PCR检测CDK5的表达变化,结果发现pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起CDK5 mRNA表达量明显高于对照组,差异呈极显著(P＜0.01)。上述结果说明F4具有较强的启动子活性,是K10启动子的核心区。【结论】成功筛选了K10的核心启动子区域F4,在角化细胞里具有启动目标基因CDK5表达的功能,因此,F4可作为黑色素细胞与角化细胞相互作用过程中基因功能研究的特异性启动子,为研究K10基因功能提供理论依据。     

不同生育期营养液钾氮比对番茄生长和果实品质的影响

采用营养液沙培技术,在番茄第一穗果坐果后,研究营养液钾氮比的调整对植株生长、果实品质、产量和植株养分含量等的影响。结果表明,坐果后增加营养液钾氮比可促进番茄植株的营养生长,显著改善果实品质,提高番茄产量,平衡植株养分吸收与分配,但钾氮比过高又会抑制这些促进作用。T4处理(K∶N=2.5∶1)可显著提高叶片叶绿素含量,提高植株光合能力,显著改善果实品质(P<0.05),但同时也显著增加了脐腐果率。T3处理(K∶N=2.1∶1)番茄总果数最多,单株产量最高,果实品质较好,根冠比及根、茎、叶的干物质含量也最高,植株根、茎、叶钾素含量居中,氮素和磷素吸收分配情况仅次于T2处理。综合营养生长、果实品质、产量等指标,认为T3处理为番茄坐果后最适的营养液钾氮比。     

酸碱胁迫对奥尼罗非鱼幼鱼鳃组织结构及Na~+-K~+-ATP酶活力的影响

[目的]探讨酸碱胁迫对奥尼罗非鱼幼鱼鳃组织结构及Na~+-K~+-ATP酶活力的影响。[方法]将初始体质量(6.81±0.85)g奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus×Oreochromis niloticus)幼鱼暴露于不同酸碱度(p H分别为4.5、6.0、7.5、9.0、10.5,依次设为试验Ⅰ、Ⅱ组、对照组及试验Ⅲ、Ⅳ组)的水体中,每组3个重复,每个重复30尾鱼。胁迫后0、12、24、48、72 h采集鱼鳃样本,采用HE染色石蜡组织切片及分光光度法比较酸碱胁迫对鱼鳃组织结构及其中Na~+-K~+-ATP酶活力的影响。[结果]对照组鱼鳃的组织结构未发现有明显病变的症状,且鳃中的Na~+-K~+-ATP酶活力维持在一定水平;各胁迫组鱼鳃组织结构均不同程度发生病变,出现鳃丝融合,动脉血管破损,鳃小片肿胀弯曲,顶端与末端粘充血和肿胀,黏液细胞增多,上皮细胞增生、脱落,泌氯细胞肿胀,细胞质空泡化等一系列病态症状,且其症状会随着酸碱程度的加深、暴露时间的延长而加重;酸碱胁迫后各胁迫组鱼鳃中Na~+-K~+-ATP酶活力均出现先升高后降低的变化,其中酸胁迫的峰值出现在48 h,而碱胁迫出现在12 h。[结论]该研究结果可为奥尼罗非鱼的养殖生产提供理论依据。     

Effects of foliar spray of two kinds of zinc oxide on the growth and ion concentration of sunflower cultivars under salt stress

This study investigated the effects of foliar application of normal and nano-sized zinc oxide on the response of sunflower cultivars to salinity. Treatments included five cultivars (‘Alstar’, ‘Olsion’, ‘Yourflor’, ‘Hysun36’ and ‘Hysun33’), two salinity levels [0 and 100 mM sodium chloride (NaCl)], and three levels of fertilizer application. Fertilizer treatments were the foliar application of normal and nano-sized zinc oxide (ZnO). Foliar application of ZnO in either forms increased leaf area, shoot dry weight, net carbon dioxide (CO₂) assimilation rate (A), sub-stomatal CO₂ concentration (Ci), chlorophyll content, Fv/Fm, and Zn content and decreased Na content in leaves. The extent of increase in chlorophyll content, Fv/Fm and shoot weight was greater as nano-sized ZnO was applied to the normal form. The results show that the nano-sized particles of ZnO compared to normal form has greater effect on biomass production of sunflower plants.     

杨树SAMT基因超表达载体的构建及遗传转化

一年生草本植物受到病原菌侵染时,体内的水杨酸甲基转移酶基因(salicylic acid methyltransferase,SAMT)能将植物侵染部位产生的水杨酸(salicylic acid,SA)转化为水杨酸甲酯(methyl salicylate,MeSA),在SA信号转导和植物系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)中起着重要作用.而多年生木本植物中SAMT基因的功能还有待进一步验证.本研究根据毛果杨(Populus trichocarpa)SAMT基因序列,设计了84K杨SAMT引物,利用Gateway克隆技术,在BP反应酶作用下,使带attB接头的SAMT基因全长开放阅读框与入门载体pDONRTM222进行BP重组反应,将目的基因转入入门载体;转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α后提取的质粒用MLUI进行酶切,然后在LR酶作用下与超表达载体pMDC32进行LR重组反应,将SAMT转入表达载体,成功构建了SAMT的超表达载体.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化,获得了SAMT超表达的84K杨转基因植株.为今后研究该基因在杨树抗溃疡病中的功能以及杨树在获得SAR和其他方面的作用提供了基础资料,同时也为研究该基因在其他多年生木本植物中的功能提供参考.     

3种桑蟥基因组DNA提取方法比较研究

为了探寻一种高效、稳定、廉价的桑蟥基因组DNA提取方法,通过采用CTAB法、蛋白酶K法和盐析法3种方法研究桑蟥基因组DNA的提取。对提取的DNA进行分光光度值的测定以及COI基因的扩增鉴定。结果表明：3种方法均可以提取基因组DNA,蛋白酶K法和CTAB法DNA获得率优于饱和NaCl法提取的DNA,3种方法提取的DNA都可用于PCR扩增实验。因此,在实际工作中可根据实验目的、条件选取最适合的方法。     

K+ and Na+ fluxes in roots of two Chinese Iris populations

Maintenance of ion homeostasis, particularly the regulation of K⁺ and Na⁺ uptake, is important for all plants to adapt to salinity. Observations on ionic response to salinity and net fluxes of K⁺, Na⁺ in the root exhibited by plants during salt stress have highlighted the need for further investigation. The objectives of this study were to compare salt adaptation of two Chinese Iris (Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz.) populations, and to improve understanding of adaptation to salinity exhibited by plants. Plants used in this study were grown from seeds collected in the Xinjiang Uygur Autonomous Region (Xj) and Beijing Municipality (Bj), China. Hydroponically-grown seedlings of the two populations were supplied with nutrient solutions containing 0.1 (control) and 140 mmol·L^-1 NaCl. After 12 days, plants were harvested for determination of relative growth rate and K⁺, Na⁺ concentrations. Net fluxes of K⁺, Na⁺ from the apex and along the root axis to 10.8 mm were measured using non-invasive micro-test technique. With 140 mmol·L^-1 NaCl treatment, shoots for population Xj had larger relative growth rate and higher K⁺ concentration than shoots for population Bj. However, the Na⁺ concentrations in both shoots and roots were lower for Xj than those for Bj. There was a lower net efflux of K⁺ found in population Xj than by Bj in the mature zone (approximately 2.4-10.8 mm from root tip). However, no difference in the efflux of Na⁺ between the populations was obtained. Population Xj of I. lactea continued to grow normally under NaCl stress, and maintained a higher K⁺/Na⁺ ratio in the shoots. These traits, which were associated with lower K⁺ leakage, help population Xj adapt to saline environments.     

花魔芋与湖北贝母一年两熟轮作栽培新模式研究

为探索花魔芋和湖北贝母的周年轮作栽培新模式,以花魔芋、湖北贝母为材料,考察其生育期、产量、病虫害、经济效益及栽培生理,探索新的轮作高效栽培模式。结果表明：花魔芋和湖北贝母轮作,生长期衔接良好,净作产量和效益分别为12377.85 kg/hm²和6189.25元/hm²,轮作中魔芋产量12489.00 kg/hm²、贝母产量8889.00 kg/hm²,总效益151335.00元/hm²。与对照相比,病害无显著差异,魔芋增产0.89%,虫害升高1.92%,综合效益高107.66%。同时,首次报道花魔芋根状茎的栽培生理问题,发现了其生育期与种芋安全贮藏的重要关系,提出生育期达184天以上方能基本保障根状茎的生理成熟。由此得出,花魔芋—湖北贝母一年两熟轮作栽培新模式可解决山区可耕作土地少、中药材野生种质资源湖北贝母过度开采等突出问题,实现生物多样性保护和经济效益的双赢。     

不同浓度钾素对甜菜幼苗生理生化指标的影响

试验采用1/2Hoagland营养液水培,研究不同浓度K⁺对甜菜幼苗生长和生理生化指标的影响。结果表明,甜菜幼苗叶片、叶柄、根系和整株的干物质量均随钾素浓度提高而增加,在K⁺浓度为3.00 mmol/L时最高;随K⁺浓度提高,甜菜幼苗根系、叶柄、叶片钾含量,幼苗全氮、磷、钾积累量,叶片、叶柄含水量,叶片相对含水量以及叶片面积随之逐步升高,3.00与6.00 mmol/L K⁺处理无明显差异;叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量,SOD、GPX活性,根系、叶柄和叶片全N含量随之逐步下降,3.00与6.00 mmol/L K⁺处理无明显差异;叶片CAT活性,根系、叶柄和叶片P含量保持不变或变化无规律。在本研究条件下,3.00 mmol/L K⁺是甜菜幼苗生长最佳营养浓度。     

小黄鱼生物学特征与资源数量的演变

通过分析20世纪50年代以来小黄鱼(Larimichthys polyactis)资源动态和生物学特征演变,阐述其生物学特征与种群数量的变动机理,揭示种群兴衰的关键因素,评估小黄鱼的渔业风险。结果显示,小黄鱼资源动态由上世纪50年代的丰盛期演变至80年代的衰退低谷期、转而又发展到90年代初期的恢复期乃至此后的稳定丰厚期;年龄结构由50年代的10龄以上缩短到80年代的1~5龄、并继续缩小至90年代以来的1~3龄,世代周期缩短;以1龄鱼为初届性成熟年龄比例由50年代的少量(5%)扩大到80年代的中等(40%)、进一步演变到21世纪初以来的大量(74%~100%);个体绝对繁殖力从60年代初至90年代初显著提高,90年代以来无显著变化;生长参数K随资源丰厚与衰退而相应地减缓与加速,具有可逆的表型特征。小黄鱼资源数量和生物学性状的变动机理表明过度捕捞可导致开发性鱼类种群衰退,但鱼类种群为抗御过度捕捞而诱导生命史特征演变,并在适宜的渔业管理措施下有望实现鱼类种群恢复;性成熟提前和繁殖力提高是种群恢复的关键因素,针对性成熟和繁殖力的演变进化程度已接近极限或达最大潜力,如不控制捕捞强度,小黄鱼渔业面临着崩溃的风险。