猪链球菌2型JX分离株的生物学特性

从临床表现为脑膜炎、关节炎及败血症的发病猪分离到2株细菌，分别命名为JX02和JX03，经鉴定其形态、染色及培养特性均符合链球菌的特点，具α或β溶血，生化试验结果不稳定。用猪链球菌2型、1型和9型抗血清进行凝集试验，结果2株菌均能与猪链球2型抗血清凝集，其中1株菌对小鼠和家兔均有致病性，另1株菌只能致死家兔。PCR均能扩增2株菌的主要毒力因子基因。表明发病猪的病原不同于以往的C群链球菌，不是马链球菌兽疫亚种，而是属于R群的猪链球菌。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏分离株ORF5及Nsp2基因部分序列分析

对2006—2007年分离于江苏省部分发病猪场的PRRSV,采用RT-PCR技术,进行ORF5基因序列以及Nsp2基因部分序列的扩增、克隆并测序。应用DNAStar软件将测序结果与已发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果表明,分离的21株病毒ORF5基因大小均为603bp;与国内分离株之间同源性为87.7%～97.0%,与国外美洲型分离株同源性为85.6%～90.5%;21株PRRSV分离株与欧洲型毒株之间的同源性仅为54.1%～56.6%。14株用于扩增Nsp2基因部分序列的PRRSV在全基因组第2778～2780位及第2947～3033位分别缺3个和87个碱基,其中的2个江苏扬州分离株在第2747～2836位又缺失了90个碱基;14个毒株之间同源性为93.2%～99.0%,与VR-2332相比同源性为74.9%～78.5%,与国内河北、河南等地2006年的PRRSV分离株相比同源性为94.1%～99.1%。     

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.     

O型口蹄疫疫苗免疫牛抗体消长动态的LPB-ELISA检测

分别按一次免疫、首免后第15d加强免疫和首免后第60d加强免疫程序，对3组试验牛（每组牛20头）用O型口蹄疫疫苗进行了免疫。免疫后不同时间点用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）测定了免疫牛O型口蹄疫抗体效价。结果，首免后第15d加强免疫牛和第60d加强免疫牛抗体水平较高，50％保护牛所占比例分别为56．3％和63．1％，完全受保护的牛所占比例分别为34．3％和29．5％。第60d加强免疫牛的保护率要高于第15d加强免疫牛和一次免疫牛的保护率。结果表明，首免后第60d加强免疫是最理想的免疫程序。     

猪链球菌2型38 000蛋白主要功能区基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的猪链球菌2型38000蛋白基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用PCR方法,以四川分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增38000蛋白主要功能区基因。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接转化宿主菌DH5α,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。将目的片段定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、0.8mmol/LIPTG条件下进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量约为35000的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western blotting)证实该重组蛋白可以与猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。     

鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已经发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2基因的高度保守序列,设计并合成了一对引物,Blast在线检索GenBank数据库,未发现其他相似序列。提取已鉴定的IBDV—QD株传代病毒尿囊液的总RNA,合成cDNA模板,优化RT-PCR反应条件,最终获得预期453bp的目的片段,IBDV扩增产物经测序结果证实与GenBank中已发表的致病力不同的IBDV毒株相应序列同源性达97．4％～99．9％,最终建立了RT—PCR检测方法。用已建立的RT—PCR方法对已知的8份临床IBDV阳性法氏囊病料进行检测,阳性率达100％,另外对2份鸡白血病病毒（ALDV）,2份鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）,2份鸡传染性支气管炎病毒（IBV）阳性病料进行平行同条件检测,结果均为阴性。表明所建立的RT—PCR特异性好、敏感性高,可用于鸡传染性法氏囊病的临床初步诊断及流行病学调查。     

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制

利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体（McAbs）进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

壳寡糖对脂多糖诱导猪空肠上皮细胞氧化损伤的作用

本试验旨在通过脂多糖(LPS)诱导猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)来建立氧化应激模型,探讨壳寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS和COS对IPEC-J2作用12、24、48 h后细胞增殖活性的变化;选择适宜浓度LPS(1.0μg/m L)和COS(200μg/m L)作用于IPEC-J2,分为对照组、LPS组、COS组、LPS+COS组。采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。结果表明:1.0μg/m L的LPS对IPEC-J2作用24 h,细胞增殖的抑制率为41.6%,为造模的最适浓度和作用时间;COS在一定浓度范围内对IPEC-J2有增殖作用,其浓度为200μg/m L时效果最佳,作用时间为24 h时,细胞增殖率达到126.3%。LPS+COS组较对照组的SOD、CAT活性和M DA含量差异不显著(P0.05),Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著升高(P0.05);LPS+COS组较LPS组的Nrf2蛋白相对表达量显著升高(P0.05),HO-1有升高趋势,但差异不显著(P0.05),SOD、CAT活性显著升高(P0.05),M DA含量显著降低(P0.05)。由此可见,LPS诱导IPEC-J2氧化应激,而COS可进一步促进Nrf2和HO-1蛋白的高表达,并提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物含量,从而增强细胞对氧化应激的抵抗力,起到保护作用。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。