慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

大黄乙醇提取物的鸡体内抗新城疫病毒试验

以雏鸡作为试验鸡,在NDVIV系病毒感染的不同时间段(感染前5～6h、感染后5～6h、感染后18～20h),以3个不同剂量的大黄乙醇提取物经皮下注射和口服给药,进行体内抗病毒试验,以脾脏中NDVIV系病毒相对含量作为抗病毒作用效果。试验结果表明,在NDVIV系病毒感染前5～6h及感染后5～6h,以3个不同剂量的大黄乙醇提取物处理,脾脏中NDVIV系病毒相对含量都明显下降;而在NDVIV系病毒感染后18～20h,以3个不同剂量的大黄乙醇提取物处理,脾脏中NDVIV系病毒相对含量下降不明显。在NDVIV系病毒感染的适宜时间,以适宜剂量大黄乙醇提取物进行防治具有一定疗效;大黄乙醇提取物在试验鸡体内抵抗NDVIV系病毒感染与给药剂量及给药时机有密切关系;大黄乙醇提取物5.0mL·kg-1·次-1大剂量组对试验鸡是安全的。     

Role of water chemistry and stabilizers on the Vero-cells-based infectivity of Newcastle disease virus live vaccine

Newcastle disease virus (NDV) live vaccines are supplied in lyophilized form and usually administered through conventional routes (drinking water, spray, or eye drop) following reconstitution in a diluent. Virus inactivation due to physico-chemical properties of the diluent at the time of administration may lead to vaccine failure. The present study aimed to evaluate the survival of NDV live vaccine strain immersed in 5 pH-amended water samples (pH 5.00, pH 6.00, pH 7.00, pH 8.00, and pH 9.00) by sequential determination of virus infectivity on Vero cells for 3 hours. Minimum reduction in virus infectivity was recorded in the water with neutral or slightly alkaline pH, while the virus was relatively less stable at extreme pH conditions. Maximum reduction of infectivity was observed in the water with pH 9.00 in which the virus was completely inactivated within 3 hours. Addition of stabilizers (Cevamune® or skimmed milk) slightly altered the pH and total dissolved solids (TDS) values of the virus-charged water samples. In the stabilizer-added water samples, minimum reduction in infectivity was observed in the water with neutral pH, followed by the ones with a pH of 8.00, 6.00, 5.00, and 9.00. In all types of water samples, T-90 values (time required for 90% reduction in virus infectivity) were highest (485 minutes) at neutral pH (pH 7.00) and lowest (102 to 134 min) at an extreme alkaline condition (pH 9.00). Results of the present study indicate that water with a pH range of 7.00 to 8.00 is suitable for administration of NDV live vaccines. However, the addition of Cevamune® or skimmed milk may have beneficial effects on preserving the infectivity of the virus, even at extreme pH conditions.     

"呼感特"对NDV和AIV的抑制试验

观察了抗病毒新药“呼感特”对鸡新城疫病毒 (NDV)和禽流感病毒 (AIV)在鸡胚中生长的抑制情况 ,结果发现 :经不同药物浓度感作的NDV和AIV在相应鸡胚中生长时 ,和对照组相比 ,鸡胚的保护率明显升高 ,病毒的增殖效价显著降低。同时 ,药物浓度越高 ,这种影响愈明显 ,且AIV组的变化比相应NDV组的变化更明显。     

牛α干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性.     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp（ARV）、264bp（AIV）、362bp（NDV）和459bp（IBV）,且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。     

鸡新城疫病毒内蒙古地方株F基因遗传变异分析

将3株新城疫病毒(NDV)内蒙分离株纯化培养后,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增F基因,并测定出F基因的全部核苷酸序列为1662bp,编码有554个氨基酸残基。与国内外发表的部分NDV的F基因核苷酸序列进行比较,结果表明这3株分离株核苷酸同源性分别为97.5%,97.9%和98.0%,与标准毒株F48E9的同源性分别为85.8%,86.4%和86.8%,与长春、河北、山东、广东、广西、浙江、韩国等地的NDV的同源性在96.3%~98.8%之间。并且这3株分离株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的强毒株裂解位点的特点。     

石香薷挥发油体外抗病毒作用研究

采用有机溶剂法提取了石香薷挥发油，采用体外细胞培养的方法研究石香薷挥发油对新城疫病毒(NDV)感染的拮抗作用，测定其对鸡胚成纤维细胞的最大无毒浓度(TDo)、半数细胞中毒浓度(TD50)、抑制50％细胞病变的药物浓度(IC50)、治疗指数(TI)及体外抗NDV效果。试验结果表明：石香薷挥发油的TDo、TD50、IC50、TI分别为1．56g／l、3.13g/l、0.20g/l、15．65，石香薷挥发油0．79g/l对NDV所致的CPE有明显的抑制作用，证明石香薷挥发油具有明显的抗NDV作用，提示石香薷挥发油可以作为一种新的抗NDV感染的药物。     

新城疫病毒在鸡胚不同组织增殖的研究

不同新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８、Ｎ－７９、ＬａＳｏｔａ和分离株Ｘ以１∶１００００稀释接种９日龄ＳＰＦ鸡胚,每胚０．２ｍｌ,结果发现,Ｆ４８Ｅ８和分离株Ｘ毒力较强,可在５０小时左右致死鸡胚,ＬａＳｏｔａ和Ｎ－７９较弱。Ｆ４８Ｅ８和Ｘ株接种鸡胚的肌肉、肝脏、脑和尿囊液均有大量病毒存在,而Ｎ－７９和ＬａＳｏｔａ只在尿囊液中有大量病毒存在,胚体病毒极少。     

新城疫活疫苗HB92克隆株的筛选、纯化与细胞培养特性观察

将引进的新城疫V4无毒耐热毒株连续用鸡胚传代.每次挑选48～96 h有明显病变的死亡鸡胚,取其尿囊液毒于-20℃保存,观察V4毒株对鸡胚毒力的病理变化.结果显示,经过20代次的鸡胚毒力筛选.V4毒株对鸡胚的致死率从小于10%上升至20%以上,接种后120 h的活胚有明显地萎缩症状.将鸡胚20代次以上筛选的V4病毒液在鸡胚成纤维细胞上传代培养,并进行蚀斑筛选纯化病毒,直到第5代才出现明显地细胞病变.使用二层琼脂进行病毒的蚀斑分析,第二层琼脂糖在第一层凝固后72 h覆盖,8 h后NDV鸡胚成纤维细胞适应株的蚀斑出现.蚀斑大小直径在1～2 mm变化.通过对NDV V4鸡胚毒力筛选和蚀斑纯化.获得了一株蚀斑克隆株(NDV HB92).