牛结核病病原体研究进展

牛结核病是一种人畜共患传染病,人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因之一。本病的传播流行直接影响着畜收业的发展,而且还会通过各种途径传染给人,给人类的健康也带来很大威胁。作者对结核病病原体的特点及分类进行了概述,并主要对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌进行了基因组比较以及它们之间的区分和鉴定进行了综述。     

某牛场奶牛A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

湖北某奶牛场牛群爆发体温升高、呼吸困难、流涎及颈胸皮下气肿等症状的疾病,部分发病牛衰竭死亡,为确诊牛场牛群发病原因并提出防控方案,本试验采集死亡牛的心脏、肝脏、肺脏及气管组织进行病原菌的分离纯化及PCR鉴定,并对鉴定的病原菌进行生化特性鉴定、致病性试验和药物敏感性分析;同时提取患牛血清RNA,开展牛流行热病毒的RT-PCR鉴定。结果显示,病料在类胸膜肺炎固体培养基上不生长,生化特性鉴定显示能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇;牛流行热病毒RT-PCR扩增阴性;所分离的病原菌经16S rRNA及牛A型多杀性巴氏杆菌特异性引物PCR扩增阳性;致病性试验显示该病原可致死小鼠,且能从死亡小鼠体内分离到感染菌;药敏试验结果显示该病菌对头孢哌酮、左氧氟沙星敏感,其他20种临床常见药物表现耐药。综上所述,该牛场患病牛确诊为牛A型多杀性巴氏杆菌感染,建议根据药敏试验结果选择敏感药物,对患病牛进行隔离治疗,疑似患病牛隔离观察,同时加强通风,及时清理污物并消毒,改善饲养管理,避免拥挤、寒冷及长途运输等应激因素。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

分解代谢物控制蛋白A对瘤胃中牛链球菌碳水化合物代谢的调控作用

分解代谢物控制蛋白A(CcpA)是低GC含量的革兰氏阳性菌基因转录的抑制或激活因子,对瘤胃微生物代谢具有调控作用。瘤胃中主要乳酸产生菌——牛链球菌(S.bovis)中的CcpA与磷酸转移酶系统(PTS)有着密切关系,对碳源次序代谢利用及碳水化合物代谢的多种关键酶具有重要的调控作用。本文综述了有关CcpA对S.bovis碳水化合物的代谢调控的研究进展,旨在为后期进一步研究S.bovis代谢产酸机制、防控反刍动物瘤胃酸中毒提供思路和参考。     

牛支原体NOX2的原核表达及黏附特性

旨在探究牛支原体（Mycoplasma bovis,Mb）NADH氧化酶NOX2的生物学功能,本研究参照GenBank中Mb湖北分离株（Mb Hubei-1 strain）nox2基因序列设计引物,应用PCR扩增获得Mb临洮分离株的nox2基因,在测序及序列优化的基础上,构建原核表达载体pET-nox2,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达,进而对表达产物rMbNOX2的酶促活性、免疫原性,NOX2在Mb内的分布,rMbNOX2抗血清的补体介导体外杀菌活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制活性进行了分析。结果表明,Mb临洮株nox2基因全长1 350 bp,与GenBank中已知序列的Mb nox2基因序列比较,除Mb JF4278株相似性为97.93%外,其余均为99.93%。SDS-PAGE结果显示,优化的nox2基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白rMbNOX2相对分子质量约为67 ku,且具有良好的酶促活性;ELISA与Western blot结果显示,rMbNOX2具有良好的免疫原性,且Mb NOX2在细胞浆中的分布多于细胞膜;补体介导的体外杀菌试验及黏附抑制试验证实,rMbNOX2抗血清具有明显的补体介导杀支原体活性,并可有效抑制Mb对宿主细胞的黏附。本研究为深入探讨Mb NOX2生物学功能奠定了基础。     

一例荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌和牛肺炎支原体混合感染犊牛的诊治

新疆某牛场的犊牛出现咳喘、鼻镜干燥、精神不振、食欲废绝、呼吸困难甚至出现死亡的症状,通过对患病牛群的发病情况、剖检、细菌分离鉴定、PCR鉴定等试验方法进行检查。结果显示:病死牛肺部可见明显出血并且伴有肺部实质性肝变;牛支原体和多杀性巴氏杆菌PCR检测都为阳性,曼氏杆菌PCR检测为阴性。通过实验室诊断最终确定该牛场为多杀性巴士杆菌和牛肺炎支原体混合感染。本研究通过病理变化、实验室诊断等方法找到病因,为此类疾病的防控提供借鉴意义。     

我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断

重庆等4省市从外省引进的肉牛群发生以严重肺炎和关节炎为主要表现的疾病。该病的病变主要集中于肺脏,其组织学变化主要是间质增生,纤维素渗出,干酪样坏死,淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞浸润。PCR检测病牛肺脏显示牛支原体阳性,而丝状支原体丝状亚种、牛分支杆菌和多杀性巴氏杆菌为阴性。从肺等组织中分离到牛支原体以及大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌和烟曲霉,没有分离到巴氏杆菌。结果显示本病是以牛支原体感染为主引起的牛支原体肺炎和关节炎,长途运输等应激因素是该病突发的重要诱因,其他细菌和/或真菌继发感染加重了病情。     

结核杆菌多位点环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,本研究根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用3种方法同时检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。LAMP检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。     

应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验

从非流行区购进无蜱寄生的健康黄牛５头与水牛犊１头，其中３头成年黄牛（２～８岁）在畜舍内用从流行区水牛身上采得的镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ成虫，置于牛耳壳内叮咬；１头运至流行区放牧，让蜱上身叮咬；１头黄牛犊（１０年龄）去蜱后２周，用液氮保存的患病水牛染虫血４ｍｌ（４×１０ ８个虫体）皮下注射；另一头去蜱水牛犊亦同时注射相同剂量的染虫血，作为对照。５头黄牛在试验期间其体温、精神、食欲正常，未出现任何临床症状，感染后１０～１２ｄ外周血液中出现少量不典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率在０．１％以下，持续３～５６消失；对照牛则体温升高（３９．８～４１．１℃），出现贫血、黄疸等症状，红细胞压积（ＰＣＶ）降至２６％，外周血液中出现典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率（ＰＰＥ）高达１２％。对采用蜱叮咬及注射来自病水牛的染虫血为何不能使黄牛感染发病，文中进行了讨论。     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.