副结核分枝杆菌McAb的某些特性鉴定

以超声波粉碎的副结核分枝杆菌地方株Ｃ２抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，经与ＮＳ－１骨髓瘤细胞三次融合，获得了３株能稳定分泌抗副结核分枝ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系，其染色体数目为７８－１１０条，分别为ＩｇＭ和ＩｇＧ２。应用间接ＥＬＩＳＡ法测定细胞培养液，腹水和血清效价为１０＾－２～１０＾－７。交叉试验证明，ＭｃＡｂＯ１与受试的各株副结核分枝杆菌反应强烈，与牛分枝杆菌和草分枝杆菌有微弱特异性抗原之一。ＳＤＳ－Ｐ     

A non-radioactive DNA probe for detecting dicyandiamide-degrading soil bacteria

Some soil bacteria are capable of degrading the nitrification inhibitor dicyandiamide (DCD). One of the most efficient isolates is strain EK1 of Mycobacterium sp. For detecting this and closely related DCD-degrading bacteria in soil we developed a non-radioactive DNA probe. A 1.7-kb EK1 DNA fragment was selected from a genomic library and labelled with digoxigenin. The probe was highly specific for EK1 and closely related or identical species of soil bacteria. A method for direct detection of DNA from soil was developed. The sensitivity of this methodology allowed detection of 2×10³ EK1 cells g^–1 soil. Received: 15 July 1996     

结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答

[目的]研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答.[方法]以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次.ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度.利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月IFN-γ浓度.[结果]免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性,1免、2免后抗体效价上升较缓,3免后抗体效价上升快.MPT83特异性抗体上升最快,抗体效价1:3200持续6个月;Ag85B特异性抗体效价1:3200持续2个月;MPT64特异性抗体效价较低.免疫奶牛中MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生IFN-γ在3免后6个月到达最高,浓度分别为(1 098.95±16.5.03)、(711.45士110.43)、(355.06±72.76) pg/mL,阴性对照组PBS刺激IFN -γ浓度为(114.5±27.46)pg/mL.阴性对照与三种抗原相比,差异均极显著(P＜0.01).[结论]多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性.     

生物体中位点2切割蛋白酶在致病菌致病机理方面的研究进展

膜内切割蛋白酶在信号传导过程中起着重要作用。Site-2 proteases（简称s2p）属于膜内切割蛋白酶中的金属蛋白酶类,如今在大多数细菌基因组中都发现了s2p。然而目前除了具有代表性的Rsep和SpolVFB蛋白酶被人们熟知之外,s2p更多的作用还未被发现。笔者就其实验结果以及结合最新关于s2p蛋白的研究数据,对s2p在细菌体内的生理生化作用及其在致病菌内致病过程中所起到作用展开一定的讨论。     

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用

从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接ELISA方法。结果显示:重组蛋白具有良好的抗原性,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(100倍)和抗原包被浓度(4.4μg.mL-1),该方法具有较好的特异性和敏感性。     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

检测牛分枝杆菌的噬菌体生物扩增法的建立及初步应用

建立噬菌体生物扩增法(PhaB)检测牛分枝杆菌,将建立的方法用于22株牛分枝杆菌临床分离株及20种常见非结核分枝杆菌(NTM)及5种非分枝杆菌,同时对203头疑患牛结核病奶牛的奶样进行检测,其结果与皮内变态试验、涂片法、罗氏培养进行比较。结果表明,噬菌体工作浓度为1×109PFU/mL、37℃感染2 h为最佳检测条件;杀毒剂浓度为100 mmol/L,室温作用10 min即可完全杀灭受试噬菌体;加热灭活的细菌和指示细菌不被噬菌体感染;牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和22株牛分枝杆菌临床分离株检测结果均为阳性,16种NTM和5种非分枝杆菌为阴性,4种NTM(偶然、胞内、金色、草分枝杆菌)在高浓度时(>105CFU/mL)检测结果为阳性;该法可检测出60~120 CFU/mL牛分枝杆菌;批内、批间变异系数均小于15%,重复性良好;203头检测奶牛中,PhaB法、涂片法、皮内变态试验和罗氏培养结果分别有14头(6.9%)、17头(8.4%)、21头(10.3%)和12头(6.0%)为阳性,PhaB法与其他3种方法比较,阳性准确性、特异性都在96%以上,敏感性在71%~100%。该法检测牛分枝杆菌具有快速、简便、灵敏、特异性高等特点。     

结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

对结核分枝杆菌的三种分泌蛋白Ag85B,ESAT-6和MPT－64基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。以结核杆菌H37RV株基因组DNA为模板，用PCR法对基因Ag85B、ESAT－6、MPT－64进行扩增，产物与载体质粒pET22b和pGEX-4T-1构建表达Ag85B、ESAT－6、MPT－64的重组质粒，将此重组质粒先转化到大肠杆菌DH5a内抽提质粒，酶切检验，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）PLysS菌株内，对转化菌株以IPTG进行诱导后，破菌，离心，上清进行SDS－PAGE电泳，电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，所表达的蛋白质相对分子质量为30000、6000、50000。结果表明：目的基因克隆到菌株内，重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT－6、MPT－64的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述三种抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

内蒙古地区部分奶牛场副结核病的血清学调查

采用ELISA检测方法对内蒙古地区17个奶牛场的2 391头奶牛进行牛副结核血清学检测。结果表明,大型奶牛场副结核的血清阳性率较低,在0~5%之间;小型奶牛场的副结核血清阳性率较高,平均阳性率为14.1%。调查结果提示,内蒙古地区奶牛场存在牛副结核病的流行,对该病的防控工作应给予高度重视。