Real-time RT-qPCR assay to detect sequences in the Piscine orthoreovirus-1 genome segment S1 associated with heart and skeletal muscle inflammation in Atlantic salmon

During the last decade, Piscine orthoreovirus was identified as the main causative agent of heart and skeletal muscle inflammation (HSMI) in Atlantic Salmon, Norway. A recent study showed that PRV-1 sequences from salmonid collected in North Atlantic Pacific Coast (NAPC) grouped separately from the Norwegian sequences found in Atlantic Salmon diagnosed with HSMI. Currently, the routine assay used to screen for PRV-1 in NAPC water and worldwide cannot differentiate between the two groups of PRV-1. Therefore, this study aimed at developing a real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) assay to target the PRV-1 genome segments specific for variants associated with HSMI. The assay was optimized and tested against 71 tissue samples collected from different regions including Norway, Chile and both coast of Canada and different hosts farmed Atlantic Salmon, wild Coho Salmon and escaped Atlantic Salmon collected in British Columbia, West Coast of Canada. This assay has the potential to be used for screening salmonids and non-salmonids that may carry PRV-1 potentially causing HSMI.     

岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量PCR内参基因的筛选与验证

实时荧光定量 PCR 已广泛用于基因表达的分析,合适的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。本研究选用正常生理状态下岩牡蛎(Crassostrea nippona)的鳃、外套膜、闭壳肌和内脏团 4 种组织以及盐度 10、20 和 30暂养 1 周后的鳃组织为材料,对已报道的常见内参基因(EF1A、GAPDH、RO21、TUB 和 TUA)的稳定性通过 3 种方法(geNorm、NormFinder 和 BestKeeper)进行分析和筛选,发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下, GAPDH 和RO21 可以作为合适内参基因,而在不同组织中,需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果。本研究是首次利用 q-PCR 对岩牡蛎进行内参基因的筛选和验证,为今后该物种低盐胁迫相关的基因表达和功能基因的研究提供重要依据。     

加压对微囊藻的影响及其生态风险探讨

近年来,利用加压使蓝藻细胞内伪空胞破裂,藻细胞因失去浮力而下沉的原理开发了一些控藻技术,如加压控藻船、深井加压控藻等,已应用于缓解富营养化水体表面的蓝藻水华堆聚问题。但对加压后下沉蓝藻的去向及其可能导致的水质生态风险尚缺乏研究。为探讨加压后微囊藻的生长变化及其对水质的影响,本文研究了加压对微囊藻的伪空胞、细胞形态、群体粒径、光合活性、漂浮率的影响,并比较了未加压和加压微囊藻在有光和无光条件下的生长差异。结果表明,在0.7 MPa、30 s加压条件下,漂浮在水体表面的微囊藻群体在加压后迅速下沉,漂浮率由95%下降至1.99%;藻细胞内的伪空胞破裂,藻细胞变形萎缩,群体粒径变小,光合活性下降,但细胞膜未破损。未加压和加压后的藻样在有光与无光条件下培养的第3天,加压下沉的藻在光照条件下有17.91%重新上浮至水体表面,并且其光合活性逐渐恢复。透射电镜结果显示上浮藻细胞内有伪空胞重新生成;同时反转录PCR结果表明,实验第3天光照加压处理组伪空胞gvpA和gvpC基因表达较其他实验组显著上调,也表明细胞进行了伪空胞合成过程。所有处理组水体中溶解性总氮(Dissolved Total Nitrogen,DTN)含量在前3天无明显变化,但3天之后均不断上升;且加压后水体中DTN含量在无光条件下比有光条件下更高。综上所述,加压控藻技术能使水体表面的水华微囊藻迅速下沉,减少表层水华;但下沉的微囊藻在有光条件下3天内能部分重新上浮,而在无光条件下更易衰亡释放有机物导致水体DTN含量增加。建议宜及时清除加压后下沉的蓝藻,避免蓝藻再次上浮形成水华,防止水质恶化。     

小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

本实验以中药提取物小檗碱为研究对象,探究其对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用。实验采用常量肉汤稀释法测定小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC);随后分别选取2 MIC、1 MIC、0.5 MIC浓度小檗碱,采用结晶紫染色法测定其对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的抑制率,同时采用实时荧光定量PCR测定2 MIC、1 MIC、0.5 MIC小檗碱对金黄色葡萄球菌Nuc基因的表达情况。结果显示,小檗碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为62.5μg/mL,2 MIC、1 MIC、0.5 MIC浓度小檗碱对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率分别为77.14%、66.91%和55.55%,荧光定量PCR测得各组金葡菌Nuc基因的Ct值大小为Ct值(0.5 MIC)> Ct值(1.0 MIC)>Ct值(2 MIC),说明随着小檗碱浓度的增大,对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增强,呈现明显的浓度依赖性。本研究为小檗碱对金黄色葡萄球菌感染的防治提供数据支持。     

PCR技术及实用方法

本文系统介绍了PCR技术的原理，反应组分、反应程序及PCR产物的电泳检测方法。这些实用的：PCR方法大都来源于国内外一些著名的实验室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性，能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。     

溶藻弧菌溶血素基因反向PCR克隆及其原核表达

溶藻弧菌的胞外产物(ECP)在其致病过程中发挥重要作用,已经观察到溶藻弧菌ECP所致的溶血现象,关于溶藻弧菌溶血素的种类和其对溶藻弧菌的致病性贡献的报道非常稀少。本文利用已经报道的多种弧菌溶血素基因序列设计通用引物,检测溶血素基因在溶藻弧菌中的分布,发现96个菌株中有74株扩增出溶血素基因(vah)片段。对致病株ZJ0451的 vah片段测序。根据已测得的片段序列设计引物,通过反向PCR扩增及后续克隆测序获得全长vah基因及部分侧翼序列。经比对证实溶藻弧菌vah与多种弧菌的TLH类溶血素高度相似,且其肽链N端有信号肽。利用pET32a载体构建了两种包含不同长度融合标签的vah表达载体,并均在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性表达。在26℃的诱导温度下,9h时vah表达量达到相对最大。在原核表达系统中,vah蛋白信号肽可以被切除。     

Molecular detection of insecticide resistant alleles

The summary discusses techniques used to investigate mechanisms of resistance in the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) to several classes of pesticides.