金龟子绿僵菌在草原羊草和克氏针茅根际的种群动态和根内宿存鉴定

绿僵菌防治草原蝗虫效果显著,其在草原田间的存活能力影响其持续控害效果。除了侵染昆虫,绿僵菌还具有在植物根际宿存和根内生的生活方式,但相关宿存规律和内生性的研究报道很少。本文研究了绿僵菌在内蒙古草原两种优势种植物羊草和克氏针茅根际的种群数量变化并对其在这两种草的根内宿存进行了鉴定。结果表明,在干旱的内蒙古草原,绿僵菌施用后种群数量在30 d内快速下降,但能够以低密度在羊草、克氏针茅根际土壤中至少延续宿存75 d,羊草根际环境比较利于绿僵菌生存。对菌株egfp基因标记的特异PCR检测证明了绿僵菌在羊草和克氏针茅根内宿存。试验数据为指导植保生物防治中充分利用绿僵菌的昆虫病原性和植物内生特性提供理论基础,也将成为绿僵菌物种生活方式多样性、与植物互作及共进化研究的重要基础。     

金龟子绿僵菌的藻胶颗粒剂型及其促进种群恢复作用

为了保护绿僵菌的存活能力并促进其田间增殖,本试验研究了以海藻胶粒剂型化金龟子绿僵菌的成胶浓度、载体、促活组分、外膜等因素对绿僵菌的存活保护与增殖促进作用。结果确定了适合于金龟子绿僵菌与海藻酸钠、钙离子交联反应的最适条件为海藻酸钠2%、氯化钙0.2~0.3 mol/L;填充4%~10%凹凸棒土支撑颗粒内部胶网,有利于孢子存活和恢复生长;添加0.5%玉米粉或糊精作为促活剂,可使孢子增殖率提高60%;以1.5%海藻酸钠与3.5%聚乙烯醇联合形成的颗粒剂外膜对抵御外界微生物侵袭有一定作用。     

不同蛋白酶抑制剂对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响

为了揭示不同蛋白酶抑制剂对绿僵菌致病力的影响,明确绿僵菌经消化道侵染东亚飞蝗的作用机制,采用分光光度法测定了经绿僵菌IPPM202及不同蛋白酶抑制剂处理后,不同时间东亚飞蝗中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶（AchE）和谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）活力的动态变化。结果表明,绿僵菌IPPM202处理后10 d内,东亚飞蝗中肠总蛋白酶活性呈现先上升再下降再上升的趋势,类胰蛋白酶活性呈先上升再下降趋势,类胰凝乳蛋白酶活性逐渐上升;但两种解毒酶的变化均为先上升后下降。加入两种抑制剂后,总体上抑制了东亚飞蝗中肠总蛋白酶和两种解毒酶的活性,降低了菌株IPPM202的侵染力,其中,甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮（tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,TPCK）作用较对脒苯基甲磺酰氯（4-amidino phenyl methane sulfonyl fluoride,APMSF）更加显著,使各种酶活力降低至与对照无差异水平。本研究对于揭示绿僵菌在中肠的致病机理及寄主对真菌侵染的免疫机制有一定的指导意义。     

蓝光促进绿僵菌产孢和产孢调节基因fluG表达

【目的】明确蓝光照射对绿僵菌产孢的促进作用及与产孢调节基因fluG表达量的关系,为绿僵菌发酵生产提供光照促进产孢的理论依据和技术参数。【方法】以绿僵菌高效杀虫菌株M202为试材,平板接种培养,通过显微观察每隔12 h的菌体发育状态,确定菌株发育进程产孢前期、初始期、旺盛期、平稳期的对应时段。以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理在黑暗中培养至不同发育期即24、48、72 h的菌体,继续培养到产孢稳定期后,采用打孔法取样,以显微计数法检测计算产孢量,评估菌体发育阶段对蓝光的敏感性以及蓝光照射能量对产孢量的影响。克隆fluG,建立fluG real-time PCR反应体系;以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理发育至48 h即处于产孢前将进入产孢期的菌丝体,照射处理后立即取菌丝,液氮冷冻,提取RNA并反转录成cDNA,通过real-time PCR检测fluG表达量,评估蓝光照射对fluG表达量的影响。【结果】绿僵菌M202菌株发育24 h前为萌发期,24-72 h为菌丝快速生长期,其中48 h还处于产孢前期,60 h已进入产孢初期,72-96 h为产孢盛期,96-120 h为产孢末期,120 h后为孢子成熟期,7-10 d后产量达到稳定。蓝光不同能量照射24 h菌龄即初期菌丝体,其产孢量与无光照处理的对照无显著差异,照射48 h菌龄即菌丝快速生长的产孢前期,其产孢量显著提高,最适照射能量为20 412-40 824 J?m^-2,其中34 020 J?m^-2使产孢量最高达无光照处理对照的1.50倍,72 h菌龄即产孢结构形成、产孢量快速增长期对蓝光最为敏感,低至6 804 J?m^-2的照射能量即可显著提高产孢量,且宽泛的各剂量均有效。对于fluG的表达,在试验照射剂量范围内,48 h菌龄接受蓝光照射后,fluG表达量显著提高,表达量随照射剂量呈先上升后下降的趋势,在20 412 J?m^-2以下较低能量时,fluG表达量与照射剂量成正相关,当照射时间为2.25 h时,表达量达到最高,为无光照处理对照的2.41倍,而在20 412 J?m^-2以上较高能量时,二者呈现负相关,随着蓝光照射时间的增加,基因表达量呈下降趋势;灰色关联度分析显示,当关联因子为0.5时,产孢量与fluG表达量的关联度r值为0.74。【结论】蓝光照射能够促进绿僵菌产孢及fluG表达,不同发育阶段的菌体对蓝光感应有显著差异,在48-72 h菌龄时照射34 020 J?m^-2能量可获得最高产孢量,产孢与fluG之间有较高关联度说明fluG参与绿僵菌产孢的调控。     

小反刍兽疫病毒F蛋白抗原位点的克隆与表达

目的表达小反刍兽疫F蛋白的抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫的抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中PPRV的F基因的抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经ITPG诱导表达PPRVF基因的抗原位点;用SDS-PAGE和Western-Blotting分析抗原位点蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-F35-111(pZLW013)、PET-28b-F143-485(pZLW014)和PET-28b-F323-485(pZLW015)酶切后,均出现与预期相符的片段;DNA测序表明插入的片段的序列与小反刍兽疫F基因的抗原位点序列分别完全一致,其大小分别为251bp、1053bp和514bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和West-ern-Blotting分析,证明小反刍兽疫抗原位点F35-111没有表达、抗原位点F143-485和F323-485得到表达。结论成功表达了PPRVF基因的两段抗原位点蛋白,为日后检测与预防工作奠定了基础。     

绿僵菌防治低密度草原蝗虫对蝗虫多样性的影响

目前草原蝗虫的防治受到国家及地方高度重视,而因化学农药对生态的破坏严重,生物农药越来越受到各界人士的青睐。针对化学农药和生物农药(绿僵菌)防治草原蝗虫后的对比进一步证实生物农药防治草原蝗虫的对生态的保护作用,同时也证实了生物农药对生物多样性也有一定的影响。     

管氏肿腿蜂及其带菌室内防治松褐天牛幼虫研究

在室内通过5菌株感染松褐天牛幼虫研究筛选出毒力相对较强菌株Ma789,然后进一步研究了其1.0×10^5-1.0×10^8个/mL不同孢子含量梯度对松褐天牛幼虫的毒力,结果显示其对松褐天牛幼虫的半致死含量为3.2×10^5个/mL;而管氏肿腿蜂对松褐天牛幼虫室内寄生试验表明,随着接蜂量的增加,管氏肿腿蜂对幼虫的寄生死亡率不断提高,当虫蜂比提高到1∶4-1∶5时,管氏肿腿蜂对松褐天牛幼虫的平均校正死亡率达96.7%;每只管氏肿腿蜂携带Ma789约1.0×10^7个孢子时,对老熟松褐天牛幼虫按虫蜂比1∶1、1∶2和1∶3接蜂,寄生感染死亡率分别为56.7%,70%和100%。     

金龟子绿僵菌防治竹笋禾夜蛾幼虫试验

在室内采用5种不同的金龟子绿僵菌菌株对竹笋禾夜蛾4龄幼虫进行感染试验,结果表明:Ma1291菌株对竹笋禾夜蛾幼虫的感染效果最好,校正死亡率达75.44%,其LT50值为8.2 d;其次是MaWP-04菌株,其校正死亡率达70.18%,LT50值为10.3 d。进一步对Ma1291和MaWP-04菌株的致病力测定结果表明,随着浓度的增加,致病力加强,其LC50分别为2.02×106孢子.mL-1和6.36×106孢子.mL-1;其致死中时间随着浓度的增加而缩短。利用Ma1291和MaWP-04菌株分别采用对笋撒菌粉和拌细砂土撒施的方法实施林间防治试验,结果表明:Ma1291菌株对竹笋禾夜蛾幼虫的防治效果达77.06%~81.36%以上,MaWP-04菌株防治效果为59.73%~67.06%。综合分析结果表明,Ma1291和MaWP-04菌株均有较好的应用效果。     

生防绿僵菌研究进展

就绿僵菌属的分类、绿僵菌侵染机制、与入侵相关的重要酶以及生防制剂的开发进行了综述,在此基础上对绿僵菌应用存在的问题及时策进行了探讨。     

蝗虫微孢子虫与绿僵菌协调使用对东亚飞蝗的毒力测定

以东亚飞蝗三龄蝗蝻为试虫,室内生物测定蝗虫微孢子虫与绿僵菌对试虫的毒力,并研究了这两种病原物以5种比例联合使用的各方面效果。结果表明,蝗虫微孢子虫与绿僵菌对东亚飞蝗LD50分别是7.72×104个/g和5.04×105个/g。两者联合使用增效显著,其中绿僵菌与微孢子虫以1∶1比例处理试虫,饲养24d的LD50（2.5×104个/g）和LD90（1.99×106个/g）均较其他比例最小,效果最佳。比较7个不同剂量处理组的致死时间,LT50从小到大为2∶1,16∶1,1∶1,1∶2,0∶1,1∶0,1∶29;LT90从小到大为2∶1,1∶1,1∶2,16∶1,1∶0,0∶1,1∶29,若同时考虑接种剂量大小,则1∶1处理组致死时间相对最佳。比较6组处理的存活试虫的蝗虫微孢子虫感染情况,各组存活试虫仍可达到较高感染率,联合使用两种病原物在统计学生对微孢子虫感染情况无显著影响。综合各方面因素,当接种剂量绿僵菌∶蝗虫微孢子虫为1∶1时,达到防治东亚飞蝗的最佳实验室配比。