CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

马铃薯3个StSnRK2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆马铃薯StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因的启动子片段,为马铃薯StSnRK2基因表达与功能研究奠定基础.【方法】以马铃薯(Solanum tuberosum L.)品种‘陇薯3号’为试材,采用PCR技术从马铃薯基因组DNA中分离得到了3个SnRK2基因启动子.通过PCR扩增,酶切鉴定,测序,利用PlantCARE和PLACE在线分析软件预测分析所得序列.【结果】获得与预期大小基本一致的目的片段,分别为StSnRK2.1基因启动子、StSnRK2.2基因启动子和StSnRK2.4基因启动子.分析软件预测分析表明,启动子调控序列中除含有典型的真核生物核心启动子外,还含有多个CAAT-box、TATA-box等启动子元件,以及相应的ABRE、DRE/CRT、LTRE等与激素应答、逆境胁迫相关的顺式作用元件.【结论】这些结果预示StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因调控机制相对复杂,可能参与了ABA,干旱,盐等多种逆境胁迫信号的转导过程,在马铃薯逆境胁迫应答过程中具有重要的功能作用.     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

小鼠MCK基因启动子的克隆及其活性初步分析

本研究克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区以及核心启动子区,并分析和研究了其调控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因组DNA为模版克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区序列,回收纯化,连接pEASY-T3 Cloning载体,测序,分析了其增强子与核心启动子序列。然后将核心启动子序列亚克隆到无启动子的荧光蛋白报告载体pGL3-Venus中,转染小鼠成肌细胞C2C12,观察其在荧光显微镜下的表达情况。结果表明,小鼠MCK基因-1354～+1 bp核心启动子序列能调控Venus荧光蛋白在C2C12细胞内表达,证实MCK启动子核心序列具有组织特异性调控能力。     

人工雄性不育基因和恢复基因的克隆及构建研究

 本文报道了用于获得人工雄性不育系的质粒pTABNBAR55和用于获得人工恢复系的质粒pTABSBAR23的构建。用PCR的方法从烟草（Nicotiana tabacum cv.Samsun）中扩增了花药绒毡层特异表达TA29基因上游-291～+12共303bp的片段，称作TA29启动子（简写作pTA29）；从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中扩增了一种RNA酶及其特异抑制剂基因barnase和barstar。DNA序列分析表明，pTA29和barstar片段均与已发表的序列完全一致，barnase片段在3′端和已见报道的两种序列都有一个碱基的差异，但由此推断的氨基酸序列是一致的，不影响其在植物中的表达。把TA29启动子分别与barnase和barstar基因连接起来构成两个嵌合基因pTA29-barnase和pTA29-barstar，在这两个嵌合基因的3′端加上了260bp的Nos终止子（Nos.ter）以增强其在植物中的表达。然后将一个2.0kb的完整除草剂抗性标记“bar cassettee”插在含有这两个基因的质粒上，作为转化和制种过程的筛选标记。若将 前者导入欲作杂交制种母本的植物中，可以获得雄性不育系；后者导入欲作父本的植物中，可获得恢复系。     

橡胶树HbHMGS1启动子对光照、干旱及热击处理的表达响应

克隆了橡胶树HbHMGS1基因上游长1 656 bp的启动子序列及其一系列5′缺失片段,并利用PlantCARE启动子预测软件对其进行分析,同时,以GUS基因作为报告基因,构建植物缺失表达载体并通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥,并对GUS蛋白的表达活性进行定性及定量检测分析。结果表明:该启动子能够在烟草叶片和T2代转基因拟南芥植株幼苗时期及成熟期不同组织器官中驱动下游GUS基因的表达,且叶片染色呈现明显的蓝色。将包含有HbHMGS1启动子的转基因拟南芥苗进行光周期处理发现,GUS蛋白活性在光照96 h处理时瞬间增大到处理72 h时的3.2倍,黑暗条件下处理72,96 h后叶片GUS活性也显著增加,分别是处理48 h时GUS活性的1.38和2.13倍。通过定量检测HbHMGS1启动子及其各缺失启动子响应热击及干旱处理的GUS蛋白活性发现,-699到起始密码子-1处的699 bp序列可能是主要的热击响应区域;干旱响应区域则主要位于-213到起始密码子-1处的213 bp序列中。结果表明,HbHMGS1启动子在调控HbHMGS1基因响应光照、热击及干旱诱导表达方面起到重要作用。     

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。     

rbcS启动子的克隆及活性鉴定

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。