绵羊角蛋白Kap6.1启动子的克隆及活性检测

克隆绵羊角蛋白Kap6.1启动子,为下一步构建真核毛囊特异表达载体奠定基础。以绵羊基因组为模板,利用PCR方法克隆绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并用此启动子置换真核表达载体pEGFP-N1的原始启动子CMV,构建pKap-EGFP质粒,通过转染内蒙古阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞鉴定启动子活性。结果显示:克隆所获得的启动子序列与NCBI上发表序列匹配率为99.6%,启动子的特征序列CAAT框和TATA框完整,并且分别位于序列的921位和878位,pKap-EGFP质粒转染绒山羊成纤维细胞后Kap能启动GFP的表达,与对照组相比活性良好。本研究通过克隆获得了绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并观测到其能启动GFP在山羊胎儿皮肤成纤维细胞中表达。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

酵母单杂交方法初步鉴定甘蔗SPSⅢ启动子区域调控序列

蔗糖磷酸合成酶(SPS,EC 2.4.1.14)是植物糖分积累的关键酶基因,在甘蔗中其家族成员SPSⅢ在成熟蔗茎中表达量高,是禾本科作物的特异成员.本研究应用酵母在甘蔗中单杂交系统,筛选SPSⅢ5’侧翼-1410～-1181 bp的光响应元件ATCT-motif和分生组织特异性元件CAT-box的调控序列,获得了54个含有cDNA片段的文库质粒,测序分析显示,14个cDNA序列为非重复性.NCBI的Blast同源性结果显示,除E1-3、E9-1和E0-3外,其余克隆都与甘蔗(Sacharum spp.)近缘物种的蛋白有很高的同源性,达到90％以上.通过SMART和SBASE,对推演的氨基酸序列进行蛋白质功能结构域预测与分析,显示编号为E0-3、E2-3、F2-1、F4-2和G8-2的5个克隆对应的氨基酸序列具有转录因子特征结构域.研究结果为分离调控SPSⅢ基因表达的转录因子提供了候选基因.     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

不同强度启动子ACC脱氨酶工程菌株的构建及功能研究

[目的]探究细菌对代谢型趋化物的代谢速率对其趋化作用强弱的影响,同时为选育高效植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)菌株开辟新路径.[方法]采用基因克隆得到4种含不同强弱启动子序列的基因片段,将其连至表达载体pBBR1MCS-2,通过三菌杂交接合转移成功构建...     

植物抗线虫基因工程新途径及其在分子育种中的应用

 植物寄生线虫种类繁多、危害严重,给世界农业生产造成巨大经济损失。目前防治线虫通常采用轮作、杀线虫药剂、生物防治和应用抗性品种等措施,但存在一定局限性。随着植物与寄生线虫之间相互作用机制的深入研究以及分子遗传操作技术的逐渐成熟,利用基因工程技术构建环保、方便、有效的线虫防治策略逐渐成为研究热点。本文从植物抗线虫基因、抑制线虫的外源活性蛋白、特异表达启动子,以及RNAi介导的抗线虫基因工程策略等方面,简要概述了国内外近年来植物抗线虫基因工程新途径研究进展以及在分子抗病育种中的应用。     

水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的分离与鉴定

为了挖掘水稻中的逆境诱导型启动子,挑选了1个受干旱胁迫强烈诱导的水稻内源基因Oshox24,分离出该基因的启动子(命名为Oshox24P),通过酶切连接的方法构建GUS报告基因表达载体并转化到受体材料中花11中,通过对转基因后代在不同逆境胁迫下的GUS活性检测,证明该启动子强烈地受到干旱胁迫的诱导,上调表达倍数至十几倍...     

50g/L唑啉草酯EC防除大麦田虉草效果评价

为了探索50g/L唑啉草酯防除冬大麦田虉草最佳用量和时期,采用50g/L唑啉草酯EC（爱秀）900~2400mL/hm24个用量进行小区试验,防除冬大麦田虉草。结果表明最佳施药时间为虉草3~4叶期,大麦4~5叶期,此时施药防除效果最好,4个用量防效均达到97%以上。50g/L唑啉草酯EC（爱秀）对麦田虉草具有较好的防治效果,显著优于对照药剂69g/L精噁唑禾草灵EW（大彪马）及人工除草。在大麦4~5叶期,虉草3~4叶期时施药,当用量达到900~1200mL/hm2,防效可达到97%以上。50g/L唑啉草酯EC（爱秀）用于冬大麦田虉草防除没有观察到对田间节肢动物的不良影响,对大麦安全,没有产生药害。     

油柰PsWRKY33基因启动子的克隆与表达分析

[目的]探讨油柰(Prunus salicina lindley)WRKY33启动子在不同胁迫处理下的表达模式,为进一步深入研究油柰WRKY基因在油柰生长发育或抵御各种逆境胁迫中的作用机制等提供理论依据.[方法]利用MEGA 6.06软件构建PsWRKY33的系统进化树.通过染色体步移技术克隆获得该基因启动子序列,利用...     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。