CTAB法高效提取苹果叶片DNA的研究

为研究CTAB法在正常条件和逆境条件下,从富含多酚和多糖等多种次生代谢物质的苹果树叶片中分离出高质量的基因组DNA,以抗旱能力较强的八棱海棠(Malus micromalusRehd. )和抗旱性较弱的平邑甜茶(Malus hupehensis pamp Reld.)幼苗为试验材料.用20%聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG6000)模拟干旱,采取CTAB提取缓冲液,按一定比例加入PVP和β-巯基乙醇,用Tris平衡酚-氯仿-异戊醇除去蛋白质及杂质,在粗提时用异丙醇沉淀DNA,并用DNA洗液(10 mmol/L醋酸铵,75%乙醇)洗涤DNA,在纯化时用乙醇沉淀DNA,且没有加入RNase去除RNA的方法,分别提取2个品种正常和干旱胁迫的苹果属叶片总DNA,并对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测.结果表明:此方法可有效去除次生物质对DNA的干扰,得到高质量、特征带形清晰的大量DNA.并就提取过程中遇到的问题,提出了相应的解决办法.     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

新疆野苹果居群年龄结构及郁闭度研究

对新疆巩留与新源2地的新疆野苹果居群年龄结构及郁闭度进行测定和分析,旨在为新疆野苹果资源的保护保存提供依据。结果表明,在随机选取的200个单株中,巩留居群Ⅰ级幼树为0,而且Ⅱ级小树数量也极少,仅2株,只占1%,年龄级构成有下降性特征,存活曲线呈断点凸型,故年龄结构应属老衰类型,郁闭度为0.47;新源居群有Ⅰ级幼树,10株占5%,Ⅱ级小树达26株占13%,年龄级构成有稳定中略有上升的特征,存活曲线呈弧形凸型,故年龄结构应属稳定类型,郁闭度为0.80。上述结果显示,巩留新疆野苹果居群破坏严重,亟待加强保护,而新源新疆野苹果居群保存较完好。     

HTPP-MDC inhibits replication and subcellular localization of hepatitis B virus in HepG2.2.15 cells

AIM：To investigate the antiviral effect of hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide and Musca domestica cecropin (HTPP-MDC) fusion polypeptide against hepatitis B virus (HBV) in vitro, and to observe the penetrating ability of HTPP-MDC in hepatocytes. METHODS： HepG2.2.15 cells and Chang liver cells were co-cultured in vitro with HTPP-MDC at different concentrations. MTT assay was used to detect the cytotoxicity of HTPP-MDC in vitro. The levels of HBsAg, HBeAg and HBV DNA in HepG2.2.15 cell culture supernatants were measured by ELISA and real-time fluorescence quantitative PCR. The penetrating ability of HTPP-MDC was detected by laser confocal microscopy. RESULTS：The levels of HBsAg, HBeAg and HBV DNA in the supernatants of HepG2.2.15 cells treated with HTPP-MDC were remarkably reduced. The inhibitory effect of HTPP-MDC depended on the dose and action time of the drug. FITC-labeled HTPP-MDC was observed inside the cells under laser confocal microscope. CONCLUSION：HTPP-MDC strongly inhibits HBV replication in HepG2.2.15 cells. The penetrating ability of HTPP-MDC into hepatocytes indicates that HTPP-MDC is useful in clinic therapy for chronic hepatitis B-related diseases in the future.     

2,4-表油菜素内酯对干旱胁迫下垂丝海棠生理特性的影响

以7～8叶龄的垂丝海棠实生苗为试验材料,研究外源喷施2,4-表油菜素内酯（EBR）对干旱胁迫下垂丝海棠幼苗光合及生理特性的影响。采用盆栽控水法,设置CK（正常水分）与干旱胁迫加6种浓度油菜素内酯处理,即T1(0 mg·L^-1)、T2(0.20 mg·L^-1)、T3(0.40 mg·L^-1)、T4(0.60 mg·L^-1)、T5(0.80 mg·L^-1)和T6(1.00 mg·L^-1),分别测定各处理下叶绿素含量、光合特性、抗氧化酶活性及渗透调节物质含量,并进行相关性与主成分分析。随干旱胁迫时间的延长,垂丝海棠叶片的Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）和蒸腾速率（T_r）均呈下降趋势;胞间CO₂浓度（C_i）、丙二醛（MDA）含量和相对电导率（REC）呈上升趋势;脯氨酸（Pro）含量、超氧化物歧化酶...     

蝇蛆几丁低聚糖对草莓保鲜作用研究

两种蝇蛆几丁低聚糖对7种草莓病原菌的抑制作用，试验结果表明酶解几丁低聚糖的抑菌活性显著高于H2O2水解几丁低聚糖，质量浓度10g／ml时，它对草莓灰霉菌等6种病原菌有强烈的抑制作用，抑菌效果在80％以上，但对草莓白粉菌的抑制作用一般；H2O2水解几丁低聚糖对草莓灰霉菌等4种病原菌也有很好的抑制效果，对草莓黑霉病菌等3种病原菌的抑制作用较差。盆栽试验结果表明蝇蛆几丁低聚糖喷雾处理可以减少生长期草莓果实的发病率，处理后第3天即表现出一定的防病效果，处理后第6天防病效果最佳．处理后第9天，防病效果开始有所下降。涂膜处理试验结果表明，在常温下，10—20mg／ml几丁低聚糖溶液处理，可使草莓的保存期延长2—3天。     

3个家蝇(Musca domestica L.)种群及其乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的敏感性研究

采用药膜法测定了3个家蝇（Musca domestica L.）种群对12种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性,采用酶动力学方法测定了不同杀虫剂对家蝇乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）的体外抑制作用。结果表明,Org种群对抗蚜威（LC50=18.654mg·L^-1）、速灭威（LC50=17.387mg·L^-1）比FAAS种群（LC50分别为26.011、26.632mg·L^-1）更为敏感,FAAS种群对仲丁威（LC50=8.271mg·L^-1）比Org种群（LC50=12.539mg·L^-1）更为敏感;除了与乙酰甲胺磷无显著差异外,FZ种群对其他供试杀虫剂的敏感性均显著低于Org种群和FAAS种群（95%CI没有重叠）。Org种群AChE对二嗪磷（IC50=0.025mg·L^-1）比FAAS种群AChE（IC50=0.048mg·L^-1）更为敏感,FAAS种群AChE对辛硫磷（IC50=0.021mg·L^-1）比Org种群AChE（IC50=0.026mg·L^-1）更为敏感;FZ种群AChE对所有供试杀虫剂的敏感性均显著低于Org种群和FAAS种群AChE（95%CI没有重叠）。     

根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究

以山定子叶片作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间对转化的影响。结果表明:预培养不利于山定子转化;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响;侵染10min,共培养3d抗性芽百分率最高;转化后叶片再生培养基的最佳激素配比为NAA1.0mg/L+BA2mg/L+TDZ4mg/L。抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。     

苹果TIFY家族基因鉴定及其在虫害胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法在苹果全基因组中鉴定了TIFY转录因子家族基因,对基因结构、蛋白保守基序和进化关系进行了分析,同时基于新疆野苹果(Malussieversii)转录组数据分析,明确了苹果TIFY家族基因在虫害胁迫条件下的差异表达情况。共鉴定到了16个苹果TIFY基因,其蛋白质大小介于209～449aa之间。16个TIFY基因分布于苹果8条染色体中,所有的MdTIFY蛋白都具有保守的TIFY结构域。其中8个苹果Md TIFY与新疆野苹果转录组测序拼接转录本对应,这些基因均含有保守的TIFY功能域,多物种进化分析表明该类蛋白可聚类成7个组。7个TIFY基因的表达量在不同处理间表现出显著差异,虫害侵染后,抗虫株系中MsTIFY10B-a表达量升高34倍,MsTIFY9-c上升5.2倍。同时抗虫株系在自然条件下茉莉酸—异亮氨酸含量显著高于敏感株系。新疆野苹果中重要抗虫响应基因MsTIFY10B-a和MsTIFY9-c位于预测关联网络节点中心位置,使它们在调节植物对生物胁迫的响应中发挥重要作用。     

苹果属植物种质多样性的SLAF-seq分析

利用简化基因组测序技术—特异性位点扩增片段测序技术(Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对509份苹果属植物种质进行测序,获得586 454个SLAF标签,其中多态性SLAF标签463 612个;经过序列比对,根据完整度> 0.94、次要等位基因频率(MAF)> 0.05,过滤筛选得到46460个多态性单核苷酸(SNP)位点;基于这些SNP位点构建苹果属植物不同种的系统发生树并分析主成分。结果表明,通过SLAF-seq技术能够在全基因组范围内快速开发高通量的SNP标记,并直接用于苹果属植物种质资源遗传多样性研究中。34种509份苹果属植物的多样性水平较高(H_e=0.318,I=0.488,A_e=1.520),在多于1份试材的种群中,变叶海棠的遗传多样性水平最高,中国苹果的遗传多样性水平最低。综合聚类分析和主成分分析结果表明,供试苹果属植物分为5个基本的类群,Ⅰ山荆子类群,Ⅱ苹果属植物野生种类群,Ⅲ苹果栽培品种类群,Ⅳ以中国苹果、八棱海棠、花红、楸子和海棠花为主...