植物抗病基因研究进展

植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用.综述了植物抗病基因的克隆方法,结构特点,作用机制以及未来的发展前景.     

枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用

本研究将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA中克隆的1.4 kbsacB基因片段连接到表达载体pET-28a(+),构建了sacB基因表达载体pSacB。通过测定蔗糖水解产生的葡萄糖具有的还原性,确定sacB基因产物具有蔗糖果聚糖酶活性。该基因表达后,导致大肠杆菌(Escherichia coli)细胞不能在含5%蔗糖的培养基中生存。同时发现sacB基因也能赋予耐辐射菌株Deinococcussp.BR501蔗糖敏感性。利用条件致死sacB基因的这一特性,我们分析了D.sp.BR501的突变率,结果表明DNA错配修复缺失突变株(ΔmutS1)的突变频率明显高于野生型。因此枯草芽孢杆菌sacB基因可作为验证DNA损伤修复能力的一种筛选标记。     

大肠杆菌Top10Na+/H+反向运输体A基因的克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的Na+/H+反向运输体(Na+/H+antiporterA,nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了nhaA基因(Acession Numeber:EU368045)。nhaA开放阅读框为1 167 bp,编码含有388个氨基酸残基,分子量为41.3 kDa的蛋白,预测等电点为9.23。nhaA含有25个碱性氨基酸,19个酸性氨基酸,211个疏水氨基酸及63个极性氨基酸。二级结构预测表明,该蛋白含约50%的α-螺旋、18%的延伸链、7%的β-转角和25%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,nhaA是疏水性蛋白。跨膜结构进行分析显示该蛋白含有11个跨膜区域。序列分析表明,大肠杆菌Top10 nhaA基因与大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HS、大肠杆菌SECEC SMS-3-5和大肠杆菌CFT073的nhaA基因同源性分别为100%、98%、95%和92%。大肠杆菌Top10 nhaA基因的克隆及生物信息学分析为今后对nhaA的进一步深入研究奠定了基础。     

西北地区草地贪夜蛾种群遗传多样性分析及治理策略

旨在明确甘肃省草地贪夜蛾的入侵来源,并制定科学有效的防控对策。基于mtCOI基因分子标记分析中国草地贪夜蛾不同生态区8个省12个地理种群276个样品的遗传多样性指数、遗传分化系数及基因流等。结果表明,甘肃省草地贪夜蛾种群的单倍型多样性指数和平均核苷酸差异数分别为0.133～0.157与0.133～0.317,均低于中国周年繁殖区广东、广西、云南种群的0.157～0.819与1.033～7.705;所有种群的Tajima’s D中性检验和Fu’s F检验结果均为负值,表明草地贪夜蛾入侵中国后经历了明显的种群扩张事件。四川种群与其他种群遗传分化显著,62个种群间存在中等程度以上的基因交流。陕西略阳、陕西宁强、甘肃徽县、甘肃成县种群的有效迁入个体数和有效迁出个体数之和分别为11 860.66、11 708.65、10 878.66和10 379.32,在中国草地贪夜蛾的基因交流过程中具有中继站的作用,表明陕南汉水谷地为中国草地贪夜蛾西线北迁入侵西北的主要通道。     

两种兼用型牛BoLA-DRA*exon2多态性及其与乳房炎的关联分析

利用PCR-SSCP技术,分析了牛主要组织相容性复合物DRA基因外显子2的多态性在236头中国西门塔尔牛、三河牛中的基因型分布及其多态性与乳房炎的关系。结果表明:经χ2独立性检验,发现该多态片段6种基因型在感染乳房炎牛和健康牛之间分布不一致(p<0.01)。在感染乳房炎牛中CC基因型频率最高,在健康牛中BC基因型频率最高。据此推测,CC基因型可能与这两种牛的乳房炎易感性有关,而BC基因型可能与这两种牛的乳房炎抗性有关。     

口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

绿鳍马面鲀雌雄性腺转录组比较分析

为探明绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)性腺发育相关基因表达特征,优化亲本生殖调控技术,本研究对绿鳍马面鲀雌雄亲体的精巢和卵巢进行了转录组测序分析,经de novo拼装,最终获得119 219个单基因(unigene),N50长度为1 255 bp。在NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO及KOG数据库分别注释到24 009、35 057、18 453、26 971、30 294、11 420和21 613个unigene。绿鳍马面鲀精巢和卵巢转录组中存在18 954个差异表达基因(DEG),相对于精巢,在卵巢中上调表达的基因有11 265个,下调表达的有7 689个。选取bmp2、sox3、figla、hsd17b1、cyp19a、cyp17、foxl2、star和amh 9个DEGs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,结果显示,qRT-PCR结果与RNA-Seq分析相一致。GO和KEGG富集结果分析发现,amh、cyp17和star可能在绿鳍马面鲀雄性精子发生过程中起关键作用;bmp2、foxl2、cyp19a、figla和hsd17b1在雌性卵子发生和卵巢类固醇生成过程中发挥重要作用。本研究通过比较绿鳍马面鲀精巢和卵巢的转录组表达差异,初步阐明了精巢和卵巢的基因表达特征,为进一步研究绿鳍马面鲀的性腺发育机制奠定了基础。     

盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白（Actin）基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草（Halogeton glomeratus）叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598 bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

Cyclin-CDK-CKI及UPP参与生殖调控及在甲壳动物性腺发育中的研究进展

泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径,参与多个生物学过程,其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用,本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF,检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式;构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp,编码119个氨基酸,含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示,Cs-UBE2D4在雌鱼的各组织中广泛表达,其中在卵巢和肝脏中表达量较高,而在雄鱼中几乎检测不到表达;在卵巢各发育阶段中,该基因的表达量从90日龄开始上调,6月龄达到峰值,之后开始下调,在1.5龄时表达量最低,在3龄时表达量有所回升,其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍。双荧光素酶活性检测结果显示,Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本实验将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论依据。     

中国沿海互花米草遗传多样性及其遗传结构

扩增互花米草(Spartina alternifora)叶绿体trnT-trnL和线粒体nad1两个基因片段,采用PCR产物直接测序法,测定中国沿海地区20个样点的基因序列,并根据互花米草的表型差异将中国沿海互花米草划分为南部、中部和北部3个种群,探讨不同种群互花米草的遗传结构和遗传多样性。结果表明,这两个基因片段的3个多态性位点可将中国沿海地区互花米草分为4种单倍型,种群的单倍型多样性指数(Hd)为0.189,Indel单倍型多样性指数(Indel Hd)为0.542,多样性全部来自种群内部;各种群的遗传距离平均值为0.028,南部种群和北部、中部种群之间基因分化系数(Gst)分别为0.015 82、0.004 15,固定指数(Fst)均为0。本研究表明,中国沿海地区互花米草遗传多样性低,具有明显的瓶颈效应,南部、中部和北部3大种群没有发生遗传分化,推测可能是表型可塑性在3大种群的表型变异上起了更大作用。另外,本研究还指出上海崇明岛互花米草种群在遗传水平上具有一定的特殊性。