中国明对虾肝胰腺细小病毒全基因组的克隆及序列分析

中国明对虾肝胰腺细小病毒是一种单链、线性DNA病毒.本研究利用DNA末端加尾和嵌套PCR首次完成了对虾肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic parvovirus,HPV)中国分离株(HPV-Pc)全基因组序列的测定,研究结果表明,HPV-Pc株(GenBank登录号GU371276)的全基因组由6085个核...     

三角帆蚌外套膜表达的免疫相关基因筛选

利用三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜cDNA文库EST序列,通过BLAST分析注释基因功能,发现35个与免疫防御功能相关的基因。根据其功能,这些免疫相关基因可划分为7类,即细胞免疫过程(2个)、蛋白酶和蛋白酶调节子(9个)、压力蛋白(7个)、抗菌肽(5个)、溶酶体酶(2个)、粘着蛋白(3个)及细胞凋亡和细胞周期调控相关基因(7个)。免疫相关基因在三角帆蚌外套膜中的广泛表达表明外套膜是重要的免疫组织。该研究为三角帆蚌外套膜分子免疫机理研究和抗病育种工作提供了基础性资料。     

鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinch...     

基于matK、rbcL和ITS序列的5种大叶藻系统发育研究

运用PCR直接测序法,对采自爱尔兰、日本、韩国和中国的大叶藻、矮大叶藻、丛生大叶藻和红须根虾形藻及GenBank中的宽叶大叶藻5种大叶藻叶绿体的matK、rbcL和核糖体ITS的部分序列进行测定,并比较分析了5种大叶藻3个目的片段的核苷酸序列,结果发现胞嘧啶(C)在3个目的片段上的含量均较低。ITS片段检测到172处核苷酸替换,表现出丰富的遗传多态性。matK基因片段上有52处核苷酸替换,rbcL基因片段上有20处核苷酸替换,且大部分替换来自于第三密码子的同义替换,种间在氨基酸水平上产生了一定的分化。基于ITS、matK和rbcL 3个目的片段,利用邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树结果基本一致,明显分为3大支。矮大叶藻与大叶藻属间3种大叶藻的核苷酸最小差异值为19.33%,在分子数据上达到了属的水平。基于matK和rbcL基因片段拼接序列的分析结果表明:大叶藻与丛生大叶藻的分化时间在上新世(2～2.7百万年前),与宽叶大叶藻的分化时间在上新世(4～5.3百万年),与矮大叶藻的分化时间在渐新世(27～36百万年前),与红须根虾形藻的分化时间在始新世(33～44百万年前)。4个地区大叶藻的...     

栉孔扇贝BES-SSR的开发及遗传多样性分析

通过分析栉孔扇贝BAC末端序列,发现大量微卫星DNA;随机选择14个多态性BES-SSR标记,在我国栉孔扇贝大连群体(DL)和青岛群体(QD)中验证标记的可用性,同时对这两个群体的遗传结构及其分化进行研究。结果表明,从17447条BESs中得到微卫星3374个,以四核苷酸重复为主(26.6%),五核苷酸重复次之(17.7%),六核苷酸重复最少(12.0%)。BES-SSR引物的扩增效率为77.3%(99/128),在作图亲本中的多态比例为33.6%(43/128),14个基因座在两群体中的平均等位基因数Na分别为18.9286和26.2143,平均有效等位基因数Ne为11.7505和17.0891,平均观察杂合度Ho为0.5100和0.4204,平均期望杂合度He为0.9156和0.9450,多态信息含量PIC分别为0.8940和0.9302,群体遗传多样性水平较高。两群体间的无偏遗传相似性系数为0.4879,遗传距离为0.7177,平均基因分化指数FST为0.0243,基因流Nm为10.0179,显示群体间遗传分化程度较弱,遗传变异主要来自于群体内个体之间,经Hardy-Weinberg平衡检验,两群体普遍存在杂合子缺失现象。研究表明,所开发的BES-SSR是高度多态位点,用于群体遗传多样性分析效果很好,显示BES是微卫星标记开发和应用的重要资源。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

池蝶蚌组织蛋白酶L1-like基因的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。     

基于16S rRNA序列探讨我国海鳝科鱼类分子系统进化关系

为从分子水平分析海鳝科鱼类分子系统分类关系,澄清物种分类争议,实验通过PCR扩增获得我国海鳝科9个属26种鱼类16S r RNA序列片段,结合GenBank下载的其他海鳝科鱼类的序列进行分析。结果显示,进化树上,海鳝科主要形成裸海鳝亚科与海鳝亚科两个分支,裸海鳝亚科包括尾鳝属与鞭尾鳝属,海鳝亚科包括裸胸鳝属、裸海鳝属、勾吻鳝属、蛇鳝属等8个属,与形态分类结果一致。裸海鳝亚科分支中,尾鳝属与鞭尾鳝属形成平行的姐妹分支;海鳝亚科分支中,斑马裸海鳝单独形成一支,位于该分支基部,其他种类聚为另一支。分支I中裸胸鳝属、勾吻鳝属、蛇鳝属、海鳝属等属均无法形成单系,揭示这些种属可能是多系起源,与近期的分子水平研究观点相似。研究结果支持将斑马裸海鳝归为裸海鳝属,为单型属物种;虎斑鞭尾鳝归为鞭尾鳝属,与尾鳝属平行进化;拟蛇鳝从长海鳝属分离出来,归为拟蛇鳝属等分类观点。豹纹勾吻鳝与海鳝属关系十分接近,但其形态上还具有多个勾吻鳝属的基本特征,至于是否归为海鳝属,还需后续更多的分子与形态学研究加以验证。     

11种鲈形目鱼类ITS2特征及系统应用

ITS2 (Internal transcribed spacer 2)是位于核糖体5.8S和28S基因之间的非编码序列。为了探讨该片段的多样性特征以及进化模式,本研究选取了鲈形目(Perciformes) 5科11种鱼类为研究对象,共获得了444条ITS2克隆序列,其长度范围为332～515 bp。比较种内不同序列的长度发现,金带细鲹(Selaroides leptolepis)在种内存在24 bp的差异,剑鱼(Xiphias gladius)在种内存在32 bp的差异,这2种鱼类的差异较为明显;其余9种鱼类的长度相对比较保守,长度差异小于14 bp。依据11种鱼类的保守位点数、变异位点数、简约信息位点数、单倍型数、保守位点比例、单倍型多样性指数、核苷酸多样性等特征分析发现,种内存在着不同程度差异,特别是金带细鲹的ITS2序列存在着Type A、Type B和Type C 3种类型,各类型间差异较大。根据序列的多样性特征推断,金带细鲹和剑鱼的进化方式为非协同进化;蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)、大甲鲹(Megalaspis cordyla)、吉打副叶鲹(Alepes djedaba)和日本竹筴鱼(Trachurus japonicas)的长度和变异位点均存在着一定程度的差异,但差异并不明显,视为不严格的协同进化;泰拉鰆鲹(Scomberoides tala)、布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、射水鱼(Toxotes chatareus)和军曹鱼(Rachycentron canadum) 5种鱼类为协同进化;另外,协同和非协同进化状态与分类系统没有相关性。序列比对发现,大甲鲹种内存在着由协同进化方式演变为非严格的协同进化方式的过度序列;在金带细鲹的3个不同个体中,序列间存在着从协同进化、非严格的协同进化演变为非协同进化的3种进化方式。基于ITS2序列构建的11种鱼类的邻接系统树显示,每种鱼类的克隆都分别按种单独聚为一支,鲹科7属鱼类各属也是单独聚支,表明ITS2不仅可以用在种类的分子鉴定,同时也可以作为分子标记应用于鲹科和属级水平的系统关系研究。