一株乳源松鼠葡萄球菌ExhC基因的克隆及序列分析

松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri,S.sciuri)是引起奶牛乳房炎(Cow Mastitis)的病原菌之一,其主要致病因子是该菌产生的脱皮毒素C(Exfoliative Toxin C,ExhC)。为了深入了解该基因的分子特征,本试验对从乳房炎患牛牛乳中分离的一株松鼠葡萄球菌ExhC基因(Genbank登录号:MT845354)进行了克隆及序列分析。按GenBank收录的ExhC基因设计并合成引物,利用PCR对ExhC基因进行扩增,并对扩增后的ExhC基因进行测序及分析。结果表明,松鼠葡萄球菌ExhC基因的开放阅读框序列长度为837bp,共编码278个氨基酸。通过Blast模块对ExhC基因进行同源性分析,得到5株相似序列,与ExhC基因序列相比同源性均为99.04%。系统进化树图指示该基因与其余五株相似序列属于不同的分支,遗传距离较远。利用TMHMM对松鼠葡萄球菌ExhC基因837bp序列跨膜区进行预测,结果显示ExhC蛋白的第1~277位氨基酸在细胞膜外,5~25位氨基酸所在位置为跨膜区。通过ExhC氨基酸序列分析和ExhC蛋白二级结构、三级结构预测,推断第97位氨基酸插入Asn以及其他位点氨基酸的突变可能会导致松鼠葡萄球菌功能区变化和毒株毒力的相对变化,这将给松鼠葡萄球菌致病机理的研究奠定基础。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

驴小肽转运载体1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

小肽转运载体1(PepT1)在动物肠道小肽的摄取过程中发挥重要作用。本试验旨在研究驴(Equus asinus)PepT1(ePepT1)基因的分子克隆、序列分析和组织表达。提取驴肠道组织总RNA,PCR克隆ePepT1基因片段,测序验证并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别测定驴肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺脏、胃、十二指肠、空肠和回肠组织中ePepT1基因的相对表达量。结果表明:ePepT1开放阅读框为2 124 bp,共编码707个氨基酸残基。蛋白质理化性质预测显示,ePepT1蛋白分子质量为78.6 ku,等电点为7.52,具有11个跨膜区(TMD),且TMD 9和TMD 10之间有1个大的细胞外环;ePepT1蛋白有5个胞外N-糖基化位点,5个胞外蛋白激酶C(PKC)作用位点和3个蛋白激酶A(PKA)作用位点。组织分布研究发现,ePepT1基因在各组织均有表达,但在肠道(十二指肠、空肠和回肠)中相对表达量最高。综上所述,本研究首次克隆了ePepT1基因,研究了其组织表达规律,为进一步研究驴肠道小肽吸收提供了基础。     

Study on Length Polymorphism of KAP1 Family Genes in Yak (Bos gurnniens)

This study was aimed to understand the characteristics of length polymorphism with repeat sequence of keratin associated protein 1 (KAP1) family genes in yak. KAP1 family genes of yak and cattle were sequenced, and compared with sheep KAP1 family gene sequences. The results showed that cattle KAP1 family genes were located in chromosome 19, according to location of sheep KAP1 family genes in the chromosome and similarity with cattle KAP1 family genes, renaming the cattle KAP1 family (according to the gene location of chromosome) B2D, B2A, KAP1-1 and B2C genes into KAP1-4, KAP1-1, KAP1-2 and KAP1-3 gene, respectively. KAP1 family genes in the 3'and 5' flank were highly conserved, the difference between family genes mainly in the the repeat sequence region, which yak KAP1 to KAP4 genes were found 30 bp length polymorphism. There were B(CCQTS)A₁(CCQPT) repeat sequence and a new repeat sequence C(SIQTS). The results indicated that the repeat sequence was the key of the polymorphism of KAP1 family genes, which might be relate to combination with keratin protein.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株E11105 N基因的序列分析与原核表达

为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用,以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增出N基因片段,利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析;将N基因克隆连接到pColdⅠ原核表达载体上,经PCR、双酶切鉴定及序列测定后,得到重组质粒pColdⅠ-N,将pColdⅠ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示,分离株E11105N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%;系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近;分离株E11105N基因所编码蛋白不存在跨膜区;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占20.33%和63.41%;预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中,分子质量约为16.7ku;Western blot结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别,显色后条带约为16.7ku,与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。     

东北地区奶牛乳房炎表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的分子流行病学及耐药性研究

为调查表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌在东北地区的流行病学情况和耐药性,本研究对来自东北地区3个大型奶牛场采集的330份奶样进行葡萄球菌的分离、鉴定及其耐药表型的检测,并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分离株的亲缘性分析,对表皮葡萄球菌进行多位点序列分型(MLST),同时应用PCR扩增分离株中携带的相关耐药基因。研究结果表明,在330份奶样中共分离到表皮葡萄球菌32株(9.7%),腐生葡萄球菌34株(10.3%);PFGE分析共获得9种不同谱型的表皮葡萄球菌和11种不同谱型的腐生葡萄球菌。药敏试验结果显示,两种菌对青霉素(70%)、苯唑西林(60%)和林克霉素(55%)的耐药率较高,主要耐药基因为lnu(B)(40%)、erm(B)(30%)和mec A(25%)。本研究结果揭示了东北地区奶牛乳房炎病原菌表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的耐药谱和流行情况,为临床合理用药及奶牛乳房炎的防控提供了实验依据。     

家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

家蚕微孢子虫烯醇化酶(Enolase)基因的克隆及序列分析与原核表达

烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。     

闽西地区猪伪狂犬病病毒变异株gC基因克隆与序列分析

为了解闽西地区2013年以来猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集了闽西不同地区的14株PRV分离株,并对其gC基因进行遗传变异分析。结果表明,14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的核苷酸序列同源性为98.8%~99.7%,而与Bartha疫苗株核苷酸序列同源性为93.6%~93.8%。氨基酸多序列比对发现,14株PRV分离株和近年来国内分离的PRV毒株gC基因氨基酸序列同源性较高,有很多相同的特征性氨基酸替换,其中最有特征性的是aa52~aa61,aa63~aa69位和aa186~aa194位氨基酸的替换和插入。遗传进化树分析表明,14株PRV分离株与2012年以来国内不同省份分离的PRV株位于一个相对独立的大分支中,且形成了一个独立的亚分支,而与Bartha疫苗株存在很大差异,亲缘关系较远。抗原表位预测分析表明,PRV闽西分离株与Bartha疫苗株相比发生了抗原漂移,该差异是否预示闽西地区流行株正在向远离疫苗株的方向变异尚有待进一步研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ—4株全基因组序列测定与分析

在国内首次完成了猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株的全基因组序列测定。用RT－PCR方法分段扩增出PRRSV北京地区分离株BJ－4株的21条cDNA片段，分别克隆于pGEM-T-easy质粒载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV BJ－4株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV BJ－4株基因组全长15504b，包含8个开放阅读框，5′端有190nt先导序列；3′端有256ntUTR，其中包括95ntPoly(A)尾。PRRSV BJ－4株与美洲型毒株VR－2332和Nebreska的核苷酸同源率分别为99．5％和98．4％，而与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源率为62．5％，与另一国内分离株CH－1a株编码构蛋白基因的核苷酸同源率为93．3％。