卷丹LlAGO1基因的克隆及表达分析

以卷丹（Lilium lancifolium）叶腋组织为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到AGO1基因的cDNA全长,命名为LlAGO1。其全长4 014 bp,开放阅读框长3 687 bp,编码1 228个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为135.36 kD,理论等电点（pI）为9.57。氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和Piwi两个AGO1典型的结构域;信号肽预测结果表明LlAGO1蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白;亚细胞定位预测其主要定位于细胞核;与相关同源蛋白高度相似,且与芦笋AGO1a蛋白（XP_020260210.1）亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明：LlAGO1在卷丹叶腋、鳞片、根、叶等不同组织均有表达,其中在叶腋中的表达量最高,叶片和根中的表达较弱;腋生珠芽形成过程中,LlAGO1仅在可形成珠芽的上部叶腋表达,且在珠芽形成时表达量最高,而在不形成珠芽的下部叶腋几乎不表达,推测LlAGO1可能与卷丹珠芽的形成相关。     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。     

河北猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3(cz)株N基因变异分析及原核表达

为了给河北地区预防和控制猪繁殖与呼吸综合征提供理论数据。应用RT-PCR方法特异性扩增HB-3(cz)株的ORF7(N)基因片段,将扩增片段克隆入pMD-T载体后测序,应用DNAstar分析软件对序列进行分析,并与GenBank中发表的PRRSV毒株序列进行比较。结果显示:HB-3(cz)株与高热病毒株JXA1、HUB2等及传统河北分离株HB-1(sh)氨基酸同源性高达97.6%,属美洲型毒株。将目的片段克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,重组质粒pGEX-N转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达,经Western-blot-ting分析表明:表达的融合蛋白分子量约为39.5 kDa,能与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,为PRRSV血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

奶牛乳房炎相关功能基因组学与蛋白质组学研究进展

功能基因组学与蛋白质组学是在基因组和蛋白质整体水平上分析基因功能,研究技术包括差异显示反转录PCR、表达序列标签、基因表达系列分析、生物芯片、RNA干涉、生物信息学、二维凝胶电泳(2-DE)、质谱(MS)等.综述了功能基因组学和蛋白质组学及其研究技术在奶牛乳房炎相关的基因表达、抗性候选基因鉴定、病原微生物蛋白质组学、基因治疗、新诊断靶标筛选等的应用研究进展及展望.     

重组基因工程乳酸菌的研究进展

乳酸菌作为人和动物体内的正常菌群,具有诸多益生功能.随着分子生物学研究的不断深入,重组基因工程乳酸菌研究取得了较快进展.在构建表达外源功能性基因的重组基因工程乳酸菌、表达保护性抗原蛋白质用以递呈黏膜免疫抗原的过程中,乳酸菌质粒载体起到了至关重要的作用.电转化技术的应用,简化了操作过程,推动了重组基因工程乳酸菌的研究与应用.     

葡萄Fe-S簇装配基因的鉴定、克隆和表达特征分析

【目的】从葡萄中克隆并鉴定Fe-S簇装配基因,在转录水平探索其组织特异性表达特征及其对缺铁胁迫的差异响应,明确主效基因。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定参与Fe-S簇装配的基因;借助生物信息学软件分析葡萄Fe-S簇装配相关基因及其编码蛋白的详细特征;利用实时荧光定量PCR分析Fe-S簇装配相关基因在葡萄不同组织部位的表达模式及其对缺铁胁迫的响应情况;利用MEGE 7.0软件建立不同植物ISU1同源蛋白的系统进化树。【结果】在葡萄基因组中检索并克隆获得46个Fe-S簇装配基因,分布于16条染色体上,含有1—21个长度不一的内含子,且主要分布于质体、线粒体和细胞质,分别含有14、21和11个基因成员;葡萄Fe-S簇装配蛋白在多种亚细胞结构中均有定位,且不同装配机制中蛋白的亚细胞定位情况差异很大;所选10种植物ISU1蛋白序列的一致性高达77%,系统发育树分析表明同一属的ISU1同源蛋白如十字花科的拟南芥和盐芥、禾本科的水稻和短柄草、蔷薇科的桃和苹果,倾向于紧密聚在一起,但葡萄ISU1和番茄ISU1紧密聚集在一起;葡萄Fe-S簇装配基因在3年生‘马瑟兰’成年树体和组培幼苗不同...     

猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及真核表达

应用特异性引物,从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出HE蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHE。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHE,回收目的基因HE片段并将其定向克隆到pPiCZαA中,构建重组质粒pPiCZαA HE。用BstXⅠ酶切pPICZαA HE使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及westem blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子量为43kD的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的HE蛋白片段在Pichia Pastoris中获得成功表达。     

口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coli BL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定.Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性.