基因枪法转化小麦幼胚瞬时表达

自Vasil et al．（1996）利用基因枪将获得小麦对除草剂Basta具有抗性的再生植株以来，基因枪介导的小麦遗传转化研究发展很快（Altpeter et al．，1996）。在小麦基因枪转化中，优化基因枪转化因素，提高转化效率仍然是基因转化的关键问题。本实验研究了不同金粉用量、质粒DNA浓度及轰击枪数对小麦幼胚瞬时表达的影响，通过GUS染色和细胞压片，分析了gus基因的瞬间表达。     

在大肠杆菌内高效表达大分子量拟蜘蛛牵丝蛋白

依据已报道的蜘蛛(Nephilaclavipes)牵丝蛋白部分cDNA序列,设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体,大小分别为360和390bp。多聚化得到8倍体和16倍体后,克隆到表达载体pET-30a,得到4种表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Westernblot检测,表达产物呈梯度排列,主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800mg/L。     

断奶前后仔猪十二指肠、空肠和回肠SGLT1 mRNA表达的变化及半胱胺的影响

研究断奶前后仔猪十二指肠、空肠和回肠SGLT1mRNA表达丰度的变化,并同时观察半胱胺对其表达的影响,从分子水平探讨半胱胺对断奶仔猪葡萄糖吸收的影响与可能的机制。新生仔猪随机分为对照组和实验组,12日龄(D12)起对照组饲喂基础乳猪料,实验组在基础乳猪料中添加120mg/kg半胱胺,两组仔猪均于35日龄断奶,每组分别于断奶前1周、断奶当天、断奶后3d、1周以及断奶后10d随机选取仔猪各6头,宰杀后采集十二指肠、空肠和回肠粘膜,采用RT-PCR方法测定钠-葡萄糖共转运载体1(sodium-glucosecotransporter1,SGLT1)mRNA表达的相对丰度。结果表明,回肠SGLT1mRNA的表达量最高,空肠其次,十二指肠最低;SGLT1mRNA在不同肠段的表达呈现截然不同的发育模式,十二指肠SGLT1mRNA表达量在45d显著上升(P<0.05),而空肠则在42和45d时显著下降(P<0.01),回肠SGLT1mRNA表达在整个实验期间无显著变化;此外,日粮添加半胱胺显著提高38d十二指肠以及42和45d空肠SGLT1mRNA表达,而对回肠SGLT1mRNA表达无显著影响。小肠SGLT1mRNA表达以及日粮添加半胱胺促进SGLT1mRNA表达的作用均呈现时空特异性规律。     

白藜芦醇合成酶(RS)基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系的筛选

白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜(Daucus carota var.sativa)则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源,在对葡萄(Vitis vinifera L.)白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)基因在胡萝卜中高效表达的密码子优化基础上构建无潮霉素磷酸转移酶(HPT)抗性基因的转化载体pCB-RS-hyg-,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将pCB和pCB-RS-hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选,获得2个白藜芦醇含量较高(11.34和15.23mg/g)的转基因胡萝卜株系。     

犬瘟热病毒Lederle株H,N全基因序列分析及表达研究

采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应,提示原核表达产物具有与CDV抗血清结合的免疫反应性。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

小鼠单个冷冻胚胎银染mRNA差异显示方法的建立

为建立单个冷冻胚胎银染mRNA差异显示方法,用小鼠单个4C鲜胚和冻胚RT—PCR产物,验证了冻胚和鲜胚实验结果的一致性。并从小鼠4C和8C冻胚的银染聚丙烯酰胺凝胶中回收了8C期的特异条带,通过再扩增、同收、克隆及酶切鉴定,克隆到了小鼠8C期胚胎差异表达的小鼠RP23—20A6基因。结果表明,所研究建立的单个冻胚银染mRNA差异显示方法具有可行性和有效性,可以用于动物早期胚胎基因表达的研究。     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

无机营养N,P,Ca和K对黑斑病菌侵染甘蓝幼苗的影响

将甘蓝幼苗分别培养在缺N(oN)、缺P(oP)、缺Ca(oCa)或缺K(oK)的不完全营养液中,培养56 d后分别于离体(Seg)和非离体(Int)叶片上接种黑斑病菌,以N,P,Ca和K营养素齐全的全营养液为对照,通过调查不同营养液处理后甘蓝叶片黑斑病的病斑大小,探讨N,P,Ca和K等无机营养素对黑斑病菌侵染甘蓝幼苗的影响。试验分2部分完成:第1部分缺N,缺P和缺Ca 3个处理同时进行,试验结果表明,不同营养液培养的甘蓝叶片黑斑病病斑大小有显著差异,顺序为对照>缺P>缺Ca>缺N处理;而在对照、缺P和缺Ca处理中,同一处理的非离体叶片病斑明显大于离体叶片病斑,缺N处理情况则相反。第2部分缺K处理的试验中,接种后5 d的病斑明显小于对照,非离体叶片与离体叶片接种后的病斑分别比对照小53%和14%;而缺K处理的离体叶片病斑显著比非离体叶片大(37%),并且病情随着接种后时间的延长而加重,在接种22 d后植株叶片和离体叶片的病斑大小趋于平衡。相关性分析表明,接种后5 d甘蓝幼苗活体组织和衰老组织的症状表达没有明显的相关性,但从试验2接种后22 d以及整个试验所有数据的结果分析,两者之间存在一定的相关性,相关系数达r=0.61。