拟态弧菌外膜蛋白OmpU 基因的原核表达及其免疫保护性研究

自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.     

嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]     

鱼类解偶联蛋白（UCP）基因研究新进展

通过生理性解偶联调节氧化磷酸化效率可能是进化早期发展起来的一种普遍策略,对生命的存在至关重要. 解偶联蛋白（uncoupling protein,UCP）家族是位于线粒体内膜的转运蛋白,哺乳动物基因组中已发现5个成员,其中UCP1~UCP3紧密相关,而UCP4和UCP5（即BMCP1,brain mitochondrial carrier protein-1）与它们差异较大. UCP1~UCP4不仅在哺乳类、鸟类等恒温脊椎动物中普遍存在,而且在鱼类等变温动物中也被证实存在,但UCP5目前仅在哺乳类中被发现. 哺乳动物褐色脂肪组织的UCP1,介导呼吸链产生的质子梯度泄漏,使氧化产生的能量以热的形式散发,但鱼类等变温动物UCP1的功能尚待进一步研究确立. UCP2和UCP3在产热、控制活性氧生成、脂肪酸氧化以及肥胖、糖尿病的发生中均发挥重要作用,二者的转录调节较复杂. UCP4和UCP5与其他UCP关系较远,UCP4仅在脑中表达,而UCP5在脑中高表达,它们的功能还不十分明确,但研究表明很可能与UCP2和UCP3的功能相似.     

Correlation between intraventricular pressure and early phase proto-oncogene expression in volume overload rats

AIM: To investigate the effect of intraventricular pressure change by volume overload (VOL) on expression of proto-oncogene c-fos,c-jun,c-myc and egr-1. METHODS: Left ventricular systolic pressure(LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rat with VOL induced by aortacaval fistula operation and rats of control group were measured at 30 min, 1, 4, 6, 12 and 48 h after the operation,these mRNAs at the foregoing time points were measured by slot bloting method and quantified with densitometry. RESULTS: Be compared with the control group, VOL rats LVSP decreased (P＜0.05) and declined most remarkably at 48 h,LVEDP elevated significantly at 30 min (P＜0.05), reached a maximal value at 12 h and the levels of control group at 48 h (P＞0.05) after the operation.The proto-oncogene expression signals were not detected in the control,negative controls and VOL rats at 30 min after the operation. The c-fos,c-jun and egr-1 mRNA signals appeared earlier,at 1 h, and c-myc mRNA increased later at 4 h.All reached peak value at 4 h and then declined gradually.The c-fos mRNA were not detected at 48 h. The c-myc,c-0jun and egr-1 mRNA persisted throught the entire observation period from 1 h to 48 h. CONCLUSIONS: During VOL early phase the overload have effect on expression of the proto-oncogene mRNA,c-fos,c-jun and egr-1 mRNA appear earlier, c-myc later,egr-1,c-jun and c-myc persist longer period, but the expressions do not strengthen with the ventricule wall load increase.This sequential induction pattern may reflect the time course regularity of the proto-oncogenes expression induced by VOL,and indicate the proto-oncogenes expression initiate while the heart load accumulate some extent and duration and the load magnitude may not play a critical role.     

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)是萜类合成途径的结构酶,对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列,分别命名为CsGGPS1-4和CsGGPS9,其中CsGGPS9存在3条等位基因,分别是CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3,在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明,茶树GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域,不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位在叶绿体上,CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模,结合"three-floor"模型对茶树GGPS家族成员的功能进行预测,预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4是GGPS;CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基;CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸。q RT-PCR分析表明,CsGGPS1整体表达丰度较低,仅在一芽二叶中表达量稍高;CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达,在花中表达量最高,且花发育过程中表达量先上升后下降;CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花,花发育过程中表达平稳;CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近,在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同;CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

茶树MADS-box转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

本研究基于茶树转录组数据库,以茶树龙井43为试验材料,通过RT-PCR方法从该茶树的cDNA中克隆得到1个CsMADS1基因。序列分析表明:茶树CsMADS1基因开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸,是典型的植物MADS-box家族转录因子。序列多重比对显示,该序列与多个相关物种的MADS-box序列一致性为65.65%,含有高度保守的MADS结构域和半保守的K结构域。氨基酸理化性质、亲疏水性、亚细胞定位预测、无序化分析,以及二级和三级结构分析显示,CsMADS1转录因子是亲水性蛋白,可能定位于细胞核中,无序化程度明显,以α-螺旋结构为主,并与人MEF2蛋白具有相似的三级结构。利用实时荧光定量PCR方法分析了茶树龙井43中CsMADS1基因在非生物胁迫下的表达。结果表明,茶树中CsMADS1基因对高温、低温、干旱和高盐等不同非生物胁迫有响应,且表达存在差异。     

玉米根部萜类合酶基因对干旱与激素处理的表达差异分析

选用两个具有抗性差异的玉米自交系B73与Mo17,分别对其根部进行干旱、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及茉莉酸甲酯与乙烯利联合(MeJA/EP)处理,定量检测4个与防御相关的萜类合酶基因An2、ZmTPS6、ZmTPS8以及ZmTPS26的表达情况。结果表明,4个基因在B73与Mo17应对干旱和ABA处理时基因表达差异明显。在Mo17中,干旱胁迫以及ABA处理显著诱导4个基因的表达;在B73中,干旱处理导致An2、ZmTPS6和ZmTPS8基因表达下调,在ABA处理下时,只有ZmTPS6被显著上调;MeJA与MeJA/EP处理在B73与Mo17中都能上调4个基因的表达,但在Mo17中的诱导程度更剧烈。B73与Mo17的根部在响应胁迫时存在显著的萜类代谢差异,可能为其抗性差异原因之一。