利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

正小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf,WBD)是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节[1]。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein, IMP)与介体异沙叶蝉肌动蛋白互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。     

Optimization of Media for Production of an Effective Yeast Biocontrol Agent Pichia membranefaciens

The growth of Pichia membranefaciens was studied using different nitrogen and carbonsources as substrates. Among nitrogen sources tested, soya peptone, yeast extract power,beef extract and polypeptone were relatively favorable to the growth of yeast. Thedensity of the yeast showed to be directly proportional to carbon sources supplementation.Glucose and fructose were good carbon sources for the yeast growth. However, lactoseshowed poor performance for the cell growth of the yeast. In this study, beef extractpresented a good synergic effect on the yeast growth with different carbonhydrates. Themedium for P.membranefaciens used glucose and beef extract as substrates. The higherconcentration of glucose and beef extract, the better growth of P.membranefaciens. Theaddition of chlorella growth factor (CGF) stimulated markedly the growth of P.membranefaci-ens. The increased concentration of CGF from 0.5 to 1% did not enhance the numbers ofP.membranefaciens. This result will help design a better strategy for scale-up produc-tion of P.membranefaciens.     

用于筛选植物PGIP的酵母双杂交PGase诱饵载体

对真菌抗性较强的植物能利用自身的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(po lyga lacturonase-inh ib iting prote in,PG IP)来抑制真菌分泌的、降解植物细胞壁的主要物质——多聚半乳糖醛酸酶(po lyga lacturonase,PG ase)的活性.目前,快速、有效的获取植物PG IP的方法是通过酵母双杂交技术来进行的,而这首先要获得真菌PG ase的酵母诱饵载体.以真菌——互格链格孢PG ase的cDNA的为基础,将其克隆到M ATCHM AKER L exA Tw o-Hybrid System的诱饵载体中,并将诱饵载体(pL exA-PG ase)成功转化酵母菌株EGY 478[p8op-lacZ],经检测无自激活作用,可直接用于快速、大量地筛选植物PG IP.     

TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1的酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

在前期研究的基础上,将成功克隆得到3个病程相关蛋白PR1、PR2和PR5的序列,分别命名为TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1。将这3个基因分别连接到酵母双杂交诱饵载体pGBKT-7上,并转化到感受态菌株Y2HGold中,检测其毒性和自激活性。结果显示,成功构建了包含目的基因的诱饵重组载体pGBKT-7-TcLr19PR1、pGBKT-7-TcLr19PR2和pGBKT-7-TaLr19TLP1;将转化产物涂布于SD/-Trp/X平板上,生长良好,并出现阳性克隆;毒性检测中,将3个诱饵重组载体与空载体在SD/-Trp液体培养基中的生长情况进行对比,发现诱饵无毒性;自激活检测试验中,重组载体无法在二缺、三缺和四缺培养基中正常生长,证明诱饵无自激活性。因此,本研究成功构建的3个诱饵重组载体可用于3个PR蛋白互作蛋白的筛选,为进一步研究其在小麦与叶锈菌互作中的分子机理奠定基础。     

乳酸菌与酵母菌混合发酵麦芽汁饮料工艺研究

为了探讨乳酸菌与酵母菌在麦芽汁发酵饮料中的应用条件,试验比较了乳酸菌在乳酸细菌培养基和麦芽汁中的生长情况,探讨乳酸菌在麦芽汁中的产酸情况以及与酵母菌混合发酵的情况。正交试验结果表明,乳酸菌与酵母菌混合发酵麦芽汁工艺最佳条件为:12%麦芽汁中接种4%(V/V)酵母菌,28℃恒温发酵8 h后经64℃恒温水浴30 min灭活,再按2%(V/V)接种保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合(1∶1,体积比)菌种,37℃恒温发酵12 h,按此工艺方案所得发酵液经杀菌后离心澄清,色泽橙黄透亮,组织均匀,具有适宜的香味且酸味醇厚。     

啤酒酵母泥中酵母多糖提取方法研究

【目的】比较不同方法对啤酒酵母泥中多糖的提取效果,旨在为啤酒酵母泥的高效利用提供依据。【方法】采用传统热水浸提法、超声波处理技术、微波辅助提取法、冻融法和酶法从啤酒酵母泥中提取多糖,比较提取效果,并研究了其中提取效果较好的2种方法对酵母多糖提取的协同作用。【结果】传统热水浸提法的酵母多糖提取率为12.8mg/g,酵母细胞破壁率为38%;采用超声波处理技术提取时,时间应控制在30min内,酵母多糖提取率最高达17.6mg/g,酵母细胞破壁率为54%;采用微波辅助提取法提取时,时间应不超过3.5min,酵母多糖提取率最高达16.6mg/g,酵母细胞破壁率达48%;采用冻融法处理啤酒酵母泥,反复冻融5次时,酵母多糖提取率最高可达13.7mg/g,酵母细胞破壁率达42%;采用酶法处理时,当木瓜蛋白酶用量为200IU/g、温度为50℃、时间为15h时,酵母多糖提取率为18.0mg/g,酵母细胞破壁率为58%;采用超声波处理技术与酶法相结合处理啤酒酵母泥时,酵母多糖提取率可达24.5mg/g,酵母细胞破壁率达75%。【结论】采用超声波处理技术与酶法提取酵母泥中的多糖时,二者具有协同作用,且提取效果较好。     

ZmCIPK8互作蛋白CBLs的筛选

利用酵母双杂交技术,以PGBKT7-ZmCIPK8载体为诱饵质粒,筛选能与ZmCIPK8互作的CBLs蛋白.结果表明,ZmCBL1,4,9能够与ZmCIPK8相互作用.表达分析结果为进一步研究ZmCIPK8与ZmCBL1,4,9在植物体内的相互作用提供了又一证据,这为深入解析ZmCIPK8参与逆境胁迫的作用机制奠定了基础.     

不同浓度啤酒废酵母酶解蛋白与硼砂组合对橘小实蝇的捕杀效果

于阳桃园和番石榴园,田间测定了不同浓度啤酒废酵母酶解蛋白与硼砂组合对橘小实蝇的诱捕和诱杀效果。结果表明:在诱捕和诱杀试验中,随着蛋白浓度和硼砂浓度的增加,酶解蛋白硼砂组合对橘小实蝇的捕杀数量呈逐渐增加趋势,以25 g/L蛋白、0.09 mol/L硼砂组合最高。通过诱捕和诱杀试验确定啤酒废酵母酶解蛋白的最佳田间使用浓度为20~25 g/L,硼砂的添加量为0.06~0.12 mol/L。     

重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061发酵生产卤醇脱卤酶的研究

用基因工程大肠杆菌E.coliP84A/MC1061生产卤醇脱卤酶,此后,进一步进行了酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101的联合调控作用研究。结果表明,用高溶解度酵母浸出物FM888替代原配方中的牛骨蛋白胨,可使E.coliP84A/MC1061生长速率增大,发酵稳定期的菌体浓度保持在较高水平,酶活提高了约2.4倍。当补料培养基中的FM888与酵母蛋白胨FP101的比例为7∶3时,菌体浓度保持在较高水平(OD600≥120),酶活进一步提高约50%,大大提高了单罐产率。此研究可为其他酶制剂的发酵生产提供借鉴。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。