AFLP技术及其在植物和病原真菌研究中的应用

综述了AFLP分子标记技术的基本原理、方法及其在植物和病原真菌研究中的应用现状,并探讨了其中存在的一些问题。     

黄鳝线粒体DNA的提取及其酶切分析

用碱裂解法从黄鳝肝脏组织中提取线粒体DNA,并对提取的线粒体DNA纯度、完整性进行了检测.结果表明,其紫外吸收比值为OD26/280在1.72～1.96之间,纯度较高,琼脂糖凝胶电泳表明提取线粒体的完整性好;用EcoR Ⅰ和HindⅢ对黄鳝线粒体DNA进行酶切,用琼脂糖凝胶电泳检测,均能检测出两套不同的酶切片段,证明黄鳝线粒体DNA存在多态性.     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

续随子ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表达特性

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的关键酶和限速酶,属于酰基转移酶超家族。为探究续随子(Euphorbia lathyris L.)中二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)对于调控种子油脂合成的作用机理,依据续随子转录组数据,采用RT-PCR技术分离和鉴定出一个 DGAT1基因(命名为 ElDGAT1),运用生物信息学方法对获得的序列进行分析,通过qPCR技术研究 ElDGAT1基因在续随子不同器官中的表达特性。结果表明:从续随子中克隆获得 ElDGAT1基因的cDNA序列,编码区长为1 530 bp,共编码509个氨基酸;预测ElDGAT1蛋白定位于内质网上,且为疏水性膜结合蛋白;其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,编码的蛋白含有9个典型的跨膜螺旋区。基于DGAT1蛋白的系统发育分析表明:续随子与乌桕的亲缘关系最近,与橡胶树和木薯的同源性次之。qPCR检测结果发现, ElDGAT1基因在续随子根中表达量最低,种子中的表达量相对较高,在花后15 d、30 d、45 d的表达量呈递增趋势。研究结果为进一步分析续随子种子油脂合成积累的调控机理及 ElDGAT1 基因的生物学功能提供依据。     

米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。     

北京水系中腐霉和疫腐霉种类调查

为研究北京地区水系中腐霉和疫腐霉种类分布,采用叶饵法从北京水系中诱集菌株,共分离到腐霉、疫腐霉182株,利用Single-strand conformation polymorphism (SSCP)进行分析,筛选出不同基因型的代表菌株,并依据形态学特征及ITS序列对这些菌株进行种类鉴定。结果共发现6个已知种和3个可能的新种,其中:湖滨疫腐霉Phytopythium litorale和果胶裂解腐霉Pythium pectinolyticum为国内新记录种;旋柄疫腐霉Pp.helicoides、异丝腐霉P.diclinum、簇囊腐霉P.torulosum和袋囊腐霉P.marsipium为北京地区新记录种。研究结果可为未来监测北京地区水系中病原菌的分布情况提供基础数据。     

德化黑鸡黑素皮质素受体1（MC1R）基因单核苷酸多态性分析

采用聚合酶链式反应及单链构象多态(PCR-SSCP)技术以及DNA直接测序的方法,对德化黑鸡MC1R基因编码区进行单核苷酸多态性(SNPs)分析。结果表明:引物P2扩增片段具有多态性,并表现为AA、AB和BB等3种基因型;经序列分析发现,BB型存在2个突变位点:分别在1094处(G-A)和1095处(T-C),其中在1095处的突变还导致氨基酸的改变(Cys-Arg)。由基因型分布情况表明,德化黑鸡C系(乌色)和D系(非乌色)均以AA型为主;BB型(含SNP)仅存在于C系中,而在D系中未发现,推测BB型可能是乌色性状特有或与乌色性状相关。     

抗除草剂转基因水稻及其生物安全性的探讨

抗除草剂转基因水稻在转基因水稻的研究和利用中占主导地位,其安全性问题也成为人们关注的焦点。文章简述了稻田中主要使用的几种除草剂及其作用机理,水稻抗除草剂基因的转化方法及抗性机理,讨论了抗除草剂转基因水稻的应用及生物安全性问题,并对今后的研究与应用进行了展望。     

Effect of EGFP gene transfection on the cell cycle distribution of primary cultured human chondrocytes

AIM: To investigate the effect of enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene transfection on the cell cycle distribution of primary cultured human chondrocytes in order to establish a tracking method of cultured human nasoseptal chondrocytes. METHODS: pEGFP-N1 plasmid was amplified in E.coli, and purified by high purity kit. Primary cultured human chondrocytes,which were initially obtained from the nasoseptal cartilage, were cultured in vitro and transferred with pEGFP-N1 by means of electroporation with Amaxa nucleofector device. Transfering process and transient expression were evaluated by laser scanning confocal microscope (LSCM), the transfer efficiency and the cell cycle distribution were evaluated by flow cytometry. RESULTS: There was significant expression of EGFP at 24 h after transferring. The transfection efficiency of pEGFP-N1 into primary cultured human chondrocytes reached 35.37％ at 48 h. It didn't affect the process of cell adherance and had no effect on the cell cycle distribution. CONCLUSION: Primary cultured human chondrocytes, which were transfected with pEGFP, are alive in vitro, and the transferring process doesn't affect the cell cycle distribution. These results suggest that pEGFP-N1 is an ideal transient expression vector for primary cultured human chondrocytes and it might be a well tracer in construction tissue engineered cartilage.